Rapports d’oncologie

Introduction

Le cancer du poumon est une tumeur maligne présentant la morbidité et la mortalité les plus élevées au monde, et son incidence augmente. Environ 80% de la maladie peut être attribuée au cancer du poumon à petites cellules (CPNPC) (1). En raison des limites des techniques de diagnostic précoce et de l’absence de manifestations cliniques spécifiques précoces, 70 à 80% des patients sont diagnostiqués à un stade avancé (2). Par conséquent, l’identification d’un traitement médicamenteux sûr et efficace pour le CPNPC est cruciale.

Des résultats récents ont montré que l’incidence, le développement et le transfert du CPNPC ne sont pas seulement influencés par des facteurs génétiques, mais que le changement épigénétique est également important, y compris l’ARN non codant de petites molécules (ARNNC) (3). Les microarn (miARN), une classe de petits arNNC endogènes d’une longueur d’environ 21 à 25 bases, largement existants chez les ineukaryotes, peuvent identifier l’ARNm d’un gène cible spécifique (4). Plus de 50% des gènes des miARNs sont cartographiés dans des sites fragiles liés au CPNPC ou dans des régions génomiques, ce qui suggère que l’expression des MIARNS peut être étroitement associée au CPNPC. Comme indiqué, l’expression d’un grand nombre de miARNs dansle CLCC montre un trouble et le déséquilibre des MIARNS favorise la progression du cycle cellulaire du CLCC, l’effet anti-apoptotique, l’invasion cellulaire renforcée et les métastases du cancer du poumon non à petites cellules (5).

La voie de signalisation PI3K/ Akt joue un rôle important dans la survie cellulaire médiée par les facteurs de croissance. Des résultats antérieurs ont montré que le trouble de la voie PI3K / Akt / mTOR peut jouer un rôle important dans la formation du CPNPC (6). Il a également été rapporté que le signal de prolifération cellulaire généré par la combinaison d’un certain nombre de récepteurs transmembranaires et de ligands peut activer la transformation du signal de PI3K / Akt / mTOR, qui est étroitement associée à la prolifération et au statut de survie du NCSCLC (7). Ces récepteurs comprennent le c-met, le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), le c-kit et le récepteur du facteur de croissance analogue à l’insuline (IGF-IR).

La curcumine est un ingrédient actif naturel extrait du rhizome sec de la plante du genre Curcuma Curcuma, curcuma Etcurcuma, avec des effets pharmacologiques étendus, une faible toxicité et une bonne tolérance, et en raison de sa valeur économique, elle est devenue un point chaud à explorer (8). Les résultats d’études axées sur la curcumine ont identifié un large éventail d’activités pharmacologiques telles qu’anti-inflammation, anti-oxydation, lipidique, anti-virus, anti-infection, anticancéreux, anticoagulant, anti-fibrose et athérosclérose du foie, une faible toxicité et peu d’effets secondaires (9-13).Cependant, l’effet de la curcumine sur le CPNPC et le mécanisme moléculaire sous-jacent reste incertain. Dans la présente étude, nous avons examiné l’effet anticancéreux de la curcumine sur la prolifération cellulaire et l’apoptose du CPNPC humain et identifié une relation possible entre cet effet et la voie PI3K/Aktsignal modulée par le miARN-192-5p.

Matériaux et méthodes

Produits chimiques

Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et le sérum foetalcalf (FBS) ont été achetés auprès de Gibco (Carlsbad, CA, USA) et (Amérique du Sud). le bromure de 3-(4,5-Diméthyl-thylthiazol-2-yl)-2,5 diphényltétrazolium (MTT) a été acheté auprès de Sangon Biotech (Shanghai, Chine). Le kit de détection d’Apoptose J’ai été acheté Debd Biosciences (San Jose, CA, USA). Le kit d’analyse d’activité caspase-3 a été acheté chez Promega (Madison, WI, États-Unis).

Culture cellulaire

Cellules épithéliales pulmonaires normales humaines NCL-H460 et BEAS-2E, et cellules cancéreuses pulmonaires humaines A549 ont été obtenues du Centre de ressources cellulaires de la Deuxième Université de médecine militaire. Ces cellules ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10% de FBS (tous deux degibco), de 100 U/ml de pénicilline et de 100 µg/ml de streptomycine à 37 ° C et dans un incubateur humidifide à 5% de CO2. Les concentrations (5,10,20 et 40 µM) et les périodes de temps (12 et 24 h) de curcumine contre les cellules A549 ont été examinées. La structure chimique de la curcumine est illustrée à la Fig.1.

Analyse de viabilité cellulaire

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 5×103/puits dans des plaques à 96 puits. En bref, la viabilité cellulaire a été mesurée par test MTT (Sangon Biotech). Dix microlitres MTT (5 mg/l) ont été ajoutés dans chaque puits et incubés pendant 4 h à 37°C dans un incubateur ahumidifié à 5% de CO2. Sulfoxyde de diméthyle (150 µl; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ont été ajoutés à chaque puits et agités pendant 20 min à température ambiante. L’absorbance a été mesurée à 450 nM à l’aide d’un lecteur amicroplate.

Analyse d’apoptose de l’annexine V-FITC/iodure de propidium (PI)

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 1×106/puits dans des plaques à 6 puits. Les cellules cultivées ont été lavées deux fois avec du PBS glacé puis colorées avec de l’Annexine V-FITC et du PI en utilisant le kit de détection d’Apoptose I selon les instructions du fabricant (BD Biosciences). L’apoptose a été analysée via flowcytometric à l’aide du logiciel CellQuest Pro (IVD) (tous deux de BDBiosciences).

Analyse de l’activation de la caspase-3

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 5×103/puits dans des plaques à 96 puits. L’activité de la caspase-3 a été mesurée à l’aide d’un kit de dosage de l’activité de la caspase-3 selon les instructions du fabricant (Promega). Cent tampons de réaction de microliters avec un substrat de 10 µl Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA) ont été ajoutés dans un lysat / puits de cellule protéique de 10 µl et incubés à 37 ° C pendant 6 h. L’activité de la Caspase-3 a été analysée à une absorbance de 405 nm.

Transfection cellulaire

Le miR-192-5p, l’anti-miR-192-5p et le contrôle négatif (miR-NC) ont tous été achetés auprès de Sangon Biotech. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits et cultivées à 50-60% de transfection priorto de confluence. Les imitations ont été transfectées avec de la Lipofectamine 2000 dans des cellules selon les instructions du fabricant (Invitrogen Life Technologies). Un gène ou une protéine a été isolé par transfection de 24 ha et utilisé pour la réaction en chaîne de la polymérase quantitative de transcription inverse (RT-qPCR) ou l’analyse par western blot, respectivement.

RT-qPCR

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 5×103/puits dans des plaques à 96 puits. L’ARN total a été extrait des cellules à l’aide du réactif TRIzol (Invitrogen Life Technologies).La concentration en ARN a été déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop®ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, États-Unis). La quantification des miARN a été réalisée parun kit de dosage des miARN TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). L’ARN total a été soumis à la synthèse d’ADNc du premier brin et examiné à l’aide d’un kit de réactifs RT PrimeScript (tous deux de Takara, Shiga, Japon). La qPCR a été réalisée à l’aide du mélange maître de PCR SYBR-Green (Takara) sur le système ABI 7500HT. Les amorces utilisées dans les actions sont indiquées dans le tableau I.

Tableau I Les amorces PCR utilisées dans les actions.

Analyse par Western blot

Les cellules ont été ensemencées à une densité de 5×103/puits dans des plaques à 96 puits. Les cellules cultivées ont été lavées deux fois avec du PBS glacé et incubées avec un tampon de lyse glacé pendant 30 min sur de la glace. Le liquide cellulaire a été recueilli et centrifugé à 12 000 × g pendant 10 min à 4 °C. La concentration en protéines solubles a été déterminée à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA (Sigma, St. Louis, MO, USA). Les protéines totales (10 µg) ont été exécutées sur des gels de dodécylsulfate de sodium (SDS)-polyacrylamide à 12% et transférées sur des membranes de polyvinylidènedifluorure (PVDF). Les membranes ont été bloquées avec une solution saline tamponnée à l’iris (SCT) contenant 5% de lait non gras pour bloquer des sites de liaison non spécifiques. Les membranes ont été incubées avecanti-PI3K (1:1500) et anti-Akt (1: 1000) (tous deux de Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) et de l’anti-β-actine (1:500; Sangon Biotech) pendant la nuit à 4°C. Après lavage avec 1% de Tween-20/PBS, les membranes ont été incubées avec les anticorps secondaires (Tiangen, Beijing, Chine) pendant 2 h à température ambiante.Les protéines ont été détectées par chimiluminescence améliorée (Vilber, Marne La Vallée, France).

Analyse statistique

Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel SPSS 19.0. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart-type. Les résultats ont été analysés à l’aide du test t de l’étudiant ou de l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA). P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

La curcumine inhibe la viabilité des cellules A549

Les concentrations (5, 10, 20 et 40 µM) etles périodes de temps (12, 24 ou 36 h) de curcumine contre les cellules A549 ont été évaluées à l’aide du test MTT. Figue.2 montre que le traitement de cellules A549 pendant 12, 24 ou 48 h avec 10, 20 et 40 µM de curcumine a inhibé la viabilité cellulaire de manière adose et dépendante du temps. Le test MTT a indiqué que le traitement à la curcumine (20 et 40 µM) pendant 24 ou 36 h a entraîné une viabilité cellulaire insignifiante, par rapport au groupe témoin (Fig. 2).

La curcumine induit l’apoptose des cellules A549

Avant le traitement, le taux apoptotique des cellules A549 traitées à la curcumine (10, 20 ou 40 µM) a également été mesuré. Après un traitement par 20 ou 40 µM de curcumine pendant 24 h, le taux d’apoptose a nettement augmenté chez un homme dose-dépendant, par rapport au groupe témoin (Fig. 3).

La curcumine induit l’activité de la caspase-3 des cellules A549

Pour déterminer si la curcumine induit l’activité de la caspase-3 des cellules A549, l’activité de la caspase-3 a été mesurée à l’aide du kit de dosage de l’activité de l’acaspase-3. L’activité de la caspase-3 a également augmentéesignificativement de manière dose-dépendante après un traitement à la curcumine (20 ou 40 µm) pendant 24 h, par rapport au groupe témoin (Fig. 4). Ces résultats ont indiqué que la curcumine induisait une apoptose dans les cellules A549.

miR-192-5p inhibe la viabilité cellulaire et induit l’apoptose des cellules A549

Pour examiner l’expression et la signification demir-192-5p dans les cellules épithéliales pulmonaires normales humaines et les cellules cancéreuses du poumon, l’expression relative de miR-192-5p a été détectée à l’aide de RT-qPCR.Figue. 5A montre que l’expression préliminaire miR-192-5 des cellules NCL-H460 était relativement plus faible, celle des cellules ofA549 était plus élevée, les cellules BEAS-2E étant les plus fortement exprimées.

Pour analyser si miR-192-5p a influencé la viabilité cellulaire et l’apoptose des cellules A549, nous avons transfecté des MIR-192-5pmimics dans des cellules A549. Les cellules transfectées avec miR-192-5pmimics ont montré une augmentation significative, multipliée par 120, de l’expression miR-192-5p après 48 h de transfection, par rapport au groupe témoin ormiR-NC (Fig. 5B).La surexpression de miR-192-5p a diminué la viabilité des cellules A549, par rapport au groupe témoin ou au groupe miR-NC (Fig. 5C). Cependant, la surexpression demir-192-5p a induit le taux d’apoptose des cellules A549, par rapport au groupe témoin ou au groupe miR-NC (Fig.5D).

L’inhibition de miR-192-5p supprime la viabilité cellulaire et induit l’apoptose des cellules A549

Pour déterminer si l’anti-miR-192-5p a influencé la viabilité cellulaire et l’apoptose des cellules A549, nous avons transfectéanti-miR-192-5p imite les cellules A549. Le niveau d’expression demir-192-5p a été détecté par RT-qPCR après 48 h de transfection.Les mimiques Anti-miR-192-5p supprimaient efficacement l’expression préalable de miR-192-5 des cellules A549 (Fig.6 BIS). La régulation à la baisse de miR-192-5p a favorisé la viabilité cellulaire et inhibé le taux d’apoptose des cellules A549, respectivement, par rapport au groupe témoin ou au groupe miR-NC (Fig.6B et C).

La curcumine inhibe l’expression du gène miR-192-5p des cellules A549

Pour déterminer si la curcumine a influencé l’expression du gène miR-192-5pgène des cellules A549, le niveau d’expression de miR-192-5p a été détecté à l’aide de la RT-qPCR après un traitement par la curcumine pendant 24h. Fig. 7 montre que le niveau d’expression de miR-192-5p a été nettement amélioré par la curcumine (20 ou 40µM).

miR-192-5p inhibe l’effet de la curcumine sur la viabilité cellulaire et induit l’apoptose des cellules A549

Pour examiner comment la surexpression de miR-192-5p a influencé l’effet de la curcumine sur la viabilité cellulaire et le taux apoptotique des cellules A549, nous avons transfecté miR-192-5p imite en cellules A549. Figue. 8 montre que la curcumine a supprimé la viabilité cellulaire et augmenté le taux d’apoptose des cellules A549 après un traitement à la curcumine (20 µM) pendant 24 h, respectivement, par rapport au groupe témoin. L’effet de la curcumine (20 µM) sur la viabilité cellulaire et le taux d’apoptose des cellules A549 ont été nettement diminués et augmentés respectivement par miR-192-5pmimics par rapport au groupe traité à la curcumine (Fig. 8 BIS).

L’inhibition de la miR-192-5p supprime l’effet de la curcumine sur la viabilité cellulaire et induit l’apoptose des cellules A549

Pour examiner comment la régulation négative de la MIR-192-5p a influencé l’effet de la curcumine sur la viabilité cellulaire et le taux d’apoptose des cellules A549, nous avons transfecté l’anti-miR-192-5p imite l’effet de la curcumine sur la viabilité cellulaire et le taux d’apoptose des cellules A549. Cellules A549. Figue. 9 montre que la curcumine a supprimé la viabilité cellulaire et augmenté le taux d’apoptose des cellules A549 après un traitement à la curcumine (20 µM) pendant 24 h, respectivement, par rapport au groupe témoin. Cependant, l’effet de la curcumine (20 µM) sur la viabilité cellulaire et le taux d’apoptose des cellules A549 ont été nettement augmentés et réduits respectivement par les imitations de l’anti-miR-192-5p par rapport au groupe traité à la curcumine (Fig.9 BIS).

La curcumine inhibe l’expression protéique PI3K / Akt des cellules A549

Pour déterminer si la curcumine a affecté l’expression protéique PI3K / Akt des cellules A549, l’expression protéique PI3K/ Akt a été détectée à l’aide d’une analyse western blot après un traitement à la curcumine pendant 24 h. Fig. 10 montre que l’expression de la protéine PI3K/ Akt a été nettement améliorée par la curcumine (20 ou 40 µM).

miR-192-5p cible directement les cellules PI3K / Akt ofA549

Pour examiner comment la surexpression de miR-192-5p a influencé l’expression de la protéine PI3K / Akt des cellules A549, MIR-192-5p transfectée imite les cellules A549. Figue. 11A et B montrent que la curcumine a supporté les expressions protéiques PI3K/ Akt des cellules A549 à la suite d’un traitement à la curcumine (20 µM) pendant 24 h, par rapport au groupe témoin. L’effet de la curcumine (20 µM) sur l’expression de la protéine Ipi3k/Akt des cellules A549 a été évidemment réduit par les imitations de la Mir-192-5p, par rapport au groupe traité à la curcumine (Fig. 11C et D).

L’inhibition de miR-192-5p augmente l’expression IPI3K / Akt des cellules A549

Pour déterminer si l’anti-miR-192-5p a influencé l’effet de la curcumine sur l’expression de la protéine PI3K / Akt des cellules A549, l’anti-miR-192-5p imite les cellules A549. Figue. 12A et B montrent que la curcumine a supporté l’expression de la protéine PI3K/ Akt des cellules A549 à la suite d’un traitement à la curcumine (20 µM) pendant 24 h, respectivement, par rapport au groupe témoin. Cependant, l’effet de la curcumine (20 µM) sur l’expression de la protéine PI3K/ Akt des cellules A549 a été nettement renforcé par des imitations anti-miR-192-5p, respectivement, par rapport au groupe traité à la curcumine (Fig.12C et D).

Discussion

Un million de patients succombent chaque année au CPNPC dans le monde entier, et l’incidence du CPNPC augmente progressivement.Bien qu’un certain nombre d’études au cours des dernières années se soient concentrées sur le CPNPC, aucun grand progrès n’a été réalisé en ce qui concerne le traitement. La chirurgie reste la méthode de traitement la plus efficace, mais en termes de prévention ainsi que pour la pathogenèse du CPNPC, d’autres études doivent être menées (14,15). Récemment, Liu et al ont identifié que la curcumine inhibe la prolifération et induit de manière significative le taux d’apoptose cellulaire des cellules cancéreuses gastriques (16). Ma et al ont démontré que la curcumine inhibe la croissance cellulaire et l’invasion des cellules cancéreuses pancréatiques (17). Collectivement, nos résultats ont indiqué que la curcumine supprimait la viabilité cellulaire, induisait l’apoptose cellulaire et augmentait l’activité de la caspase-3 des cellules A549.Par conséquent, la curcumine est un médicament potentiel pour l’oncothérapie.

Les MIARN sont une classe d’ARN à petites molécules qui joue un rôle important dans la régulation de l’expression génique, comme récemment identifié (18). Les gènes miarns sontgénéralement situés dans des segments intron du gène. Cependant, les MIARN sont également distribués en dehors des exons non codants du gène et de la région intergénique, qui participent à une variété de voies oncogènes connues, telles que p53, Bcl-2 et K-Ras (19). Il a été démontré que > 50% des MIARN humains définis sont localisés dans les sites fragiles du génome et que ces sites fragiles sont souvent associés à l’apparition du CPNPC (20). Les profils d’expression des MIARN sont associés au développement du CPNPC. miR-34c, miR-145 et miR-142 peuvent inhiber le CPNPC (5). Les résultats de la présente étude indiquent que l’expression relative de miR-192-5p des cellules NCL-H460 était relativement faible, celle des cellules A549 était plus élevée, les cellules BEAS-2E étant les plus fortement exprimées. La surexpression de miR-192-5p a diminué la viabilité cellulaire et augmenté le taux d’apoptose des cellules A549. La régulation négative de miR-192-5p a augmenté la viabilité cellulaire et réduit le taux d’apoptose des cellules A549.De plus, la curcumine a inhibé l’expression du gène miR-192-5p des cellules A549. Cependant, la régulation à la hausse de l’expression de miR-192-5p a renforcé l’effet de la curcumine sur la viabilité cellulaire et le taux apoptotique des cellules A549, tandis que la régulation à la baisse de l’expression de miR-192-5p a inversé l’effet de la curcumine sur les cellules A549. Nos résultats étaient cohérents avec ceux d’autres études. Par exemple, Ye etal a rapporté que la curcumine favorise l’apoptose cellulaire en activantmir-192-5p (21). Cependant, les mécanismes probables sur la façon dont la curcumine influence l’expression de miR-192-5 ne sont pas clairs et des études futures pour déterminer cet effet devraient être effectuées.

Au cours des dernières années, l’effet de la voie PI3K/Aktsignaling sur le CPNPC humain a attiré beaucoup d’attention (22). L’activation de la voie PI3K / Aktsignaling est très fréquente dans le CPNPC humain, ce qui peut favoriser l’apparition du cancer par divers mécanismes, y compris les mutations de gènes, la réduction de la PTENexpression du gène suppresseur du cancer, la mutation ou l’amplification PI3K, la mutation ou l’amplification Akt et l’activation des récepteurs oncogènes (7). L’activation de chaque composant de cette voie est la principale raison du pronostic défavorable du CPNPC, qui peut entraîner une résistance aux médicaments du traitement, de sorte que l’inhibition de cette voie peut inverser la résistance aux médicaments et améliorer les effets de la chimiothérapie et des radiations in vivo (23). Les données obtenues dans la présente étude ont révélé que la curcumine supprimait l’expression protéique PI3K/Akt des cellules A549. La régulation à la hausse de l’expression miR-192-5p a freiné l’expression de la protéine PI3K / Akt des cellules A549.La régulation négative de l’expression de miR-192-5p peut augmenter l’expression de PI3K/Aktprotéine des cellules A549. Xu et al ont démontré que la curcumine inhibe l’invasion et la migration de la cellule FTC133 via la régulation négative de la voie de signalisation PI3K / Akt dans les cellules cancéreuses thyroïdiennes (24). Xu et a également suggéré que la curcumine inhibe la prolifération tumorale du cancer du poumon par la voie PI3K / Akt (25).Schee et al ont révélé que miR-22-3p, miR-143-3p etmir-192-5p régulaient et étaient impliqués dans les voies APC, TGFß et PI3K dans les cellules cancéreuses colorectales (26).

En conclusion, cette étude s’est concentrée sur l’effet de la curcumine contre les cellules A549, l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’apoptose induite du CPNPC humain par la régulation à la hausse du REM-192-5p et la suppression de la voie de signalisation PI3K / Akt. Les conclusions de la présente étude indiquent que la curcumine est une cible apotentielle dans le traitement du CPNPC. Cependant, l’étude actuelle a révélé certaines limites car nous n’avons pas examiné la relation détaillée entre miR-192-5p et la voie PI3K / Akt dans les cellules du cancer du poumon. Des études supplémentaires in vivo, des analyses statistiques cliniques et à plus grande échelle de la présente étude doivent être effectuées pour vérifier les résultats.