Braz J Med Biol res, 2004. május, kötet 37(5) 625-634
a reverz transzkripció-PCR alkalmazása X-hez kapcsolódó krónikus granulomatózus betegség diagnosztizálására
P. Agudelo-FL Xhamrez1, J. A. L Xhampez1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 és A. Condino-Neto1
1centro de Investigatia GmbH gyermekgyógyászat, valamint a campinasi Állami Egyetem Orvostudományi Karának gyermekgyógyászati és farmakológiai tanszékei, Campinas, SP, Brazília
2immunológiai mentőszolgálat, Biomedical Sciences Intézet, Universidade De S Argento Paulo, s Argento Paulo, SP, Brazília.
3disciplina of Allergy, Immunology and Rheumatology, Department of Pediatrics, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de S Unconpo Paulo, s Unconpo Paulo, SP, Brazília.
4laborat enterprio Medical Research 56, Bőrgyógyászati Tanszék, Orvostudományi Kar,, Universidade De S Oncho Paulo, s Oncho Paulo, SP, Brasil
absztrakt Bevezetés betegek és módszerek eredmények
Vita Köszönetnyilvánítás levelezés és lábjegyzetek
absztrakt 
a krónikus granulomatózus betegség (CGD) a veleszületett immunrendszer örökletes rendellenessége, amelyet a fagociták hibás oxidatív burstje és mikrobicid aktivitásuk későbbi károsodása jellemez. Az egyik NADPH-oxidáz komponens mutációi befolyásolják a rendszer génexpresszióját vagy működését, ami a CGD fenotípusához vezet. A gp91-phox hibái X-kapcsolt CGD-hez vezetnek, amely a CGD-esetek körülbelül 70% – áért felelős. A CGD-s betegek rendkívül heterogén genotípusának vizsgálata magában foglalja a mutációs elemzést, az Északi blot vagy a Western blot vizsgálatokat az adott esetnek megfelelően. Jelen tanulmány célja a reverz transzkripció (RT)-PCR alkalmazása volt az X-kapcsolt CGD-ért felelős molekuláris hibák elemzésére nyolc Brazil betegnél, valamint annak felmérésére, hogy szélesebb körben alkalmazható-e a molekuláris szűrés a CGD-ben. A teljes RNS-t Epstein B vírus által transzformált B-limfocitákból állítottuk elő, és véletlenszerű hexamerek segítségével reverz transzkripcióval írtuk le. A kapott cDNS-t PCR-amplifikáltuk specifikus és egymást átfedő primerpárokkal, amelyek a gp91-phox gén három régióját amplifikálták: az 1-5, 3-9 és 7-13 exonokat. Ez a stratégia hét betegnél hibás gp91-phox expressziót észlelt. Az RT-PCR eredmények megfeleltek a klinikai anamnézisnek, a biokémiai adatoknak (nitroblue tetrazolium vagy szuperoxid felszabadulási teszt) és a rendelkezésre álló mutációs elemzésnek négy esetben. Három további esetben az RT-PCR eredmények megfeleltek a klinikai anamnézisnek és a biokémiai adatoknak. Egy másik esetben az RT-PCR normális volt annak ellenére, hogy a klinikai kórtörténet kompatibilis a CGD-vel és a hibás légzési burst. Megállapítottuk, hogy az RT-PCR analízis új alkalmazása – egy egyszerű, gazdaságos és gyors módszer – alkalmas volt a molekuláris hibák szűrésére 7 8 X-kapcsolt CGD-s betegben.
kulcsszavak: szuperoxid, fagociták, elsődleges immunhiány, légzési burst, neutrofilek, humán
Bevezetés
a krónikus granulomatosus betegség (CGD) egy elsődleges immunhiány, amelyet eredetileg 1957-ben írtak le a férfi csecsemőket érintő klinikai entitásként, és akkoriban gyermekkori halálos granulomatózus betegségnek nevezték. A CGD fő jellemzői A visszatérő és súlyos fertőzések, amelyek magukban foglalják a szervezet természetes akadályait, például a légutakat és a nyirokcsomókat, és végül a belső struktúrákat, például a májat, a lépet, a csontokat és az agyat (1-3). Ennek a ritka betegségnek a becsült előfordulása évente 1/250 000 élveszületés. A fertőzéseket általában kataláz-negatív baktériumok, például Staphylococcus aureus, Gram-negatív bacillusok és gombafajok, például Aspergillus, Candida és Nocardia okozzák (4,5).
a NADPH-oxidáz rendszer szuperoxidot és más reaktív oxigén intermediereket hoz létre, amelyek elengedhetetlenek a fagociták mikrobicid aktivitásához. A CGD biokémiai hibája a NADPH-oxidáz aktivitás károsodása, majd a mikroorganizmusok elpusztításának képtelensége (6). A NADPH-oxidáz rendszer fő összetevői a gp91-, p22-, p47-, p67-és p40-phox. A CGD-t okozó molekuláris hibák általában a NADPH-oxidáz egyik komponensének hiánya, alacsony expressziója vagy hibás működése miatt következnek be. Ennek a betegségnek az X-kapcsolt formáját a gp91-phox, a citokróm b588 nehéz láncának hibái okozzák, és az összes eset körülbelül 70% – át teszi ki (7,8). Az autoszomális recesszív formákat a NADPH – oxidáz egyik citoszolos komponensének (p47-vagy p67-phox, az esetek 20, illetve 5% – ában) vagy a citokróm b588 könnyű lánc komponensének (p22-phox, az esetek 5% – ában) (9,10) hibái okozzák. A CGD rendkívül heterogén állapot: több mint 300 mutációt regisztráltak egy nemzetközileg karbantartott X-CGD adatbázisban (8). A mutációk nagyrészt a 13 exonon belül vagy a gp91-phox (CYBB) gén exon/intron határán oszlanak meg, és ezek közül csaknem 200 egyedi.
a CGD diagnózisa általában a betegség klinikai jellemzőin, valamint a hibás NADPH-oxidáz aktivitáson alapul, amint azt abnormális nitroblue tetrazolium (NBT), dihidrorhodamin 123 vagy szuperoxid felszabadulási vizsgálatok bizonyítják (11,12). A stimulált NBT tesztben a normál egyének közel 100% – ban pozitív sejteket mutatnak, míg a CGD-s betegeknél a sejtek kevesebb mint 5% – a pozitív (13). Ezenkívül a CGD variánsban szenvedő betegek sejtjei pozitívak, de csak nagyon alacsony aktivitást mutatnak (6). Az NBT teszt kimutatja az X-kapcsolt CGD hordozóit is (anyák és nővérek). A végleges molekuláris CGD diagnózist kóros NBT-teszttel vagy légzési burst aktivitással rendelkező betegeknél állapítják meg, akik a következő jellemzők egyikével rendelkeznek: mutáció a gp91-, p22-, p47-vagy p67-phox-ban; hiányzik az mRNS ezen gének egyikében, amelyet Northern blot analízis kimutatott; és/vagy hiányzik a fehérje ezen oxidáz komponensek egyikében a Western blot által. Genetikai, de nem molekuláris diagnózist lehet megállapítani az anyai unokatestvérek, nagybácsik vagy unokaöccsek abnormális NBT-teszttel vagy légzési felszakadással történő bemutatásával (14). Így ennek a ritka és rendkívül heterogén betegségnek a végleges diagnosztizálása összetett és drága módszereket igényel, mint például az északi vagy a Western blot kombinációja, valamint az egyszálú konformációs polimorfizmus elemzése (SSCP), amelyet több családtag DNS-szekvenálása követ, mindezt nagy komplexitású kutatólaboratóriumokban végzik.
a reverz transzkripciós PCR (RT-PCR) módszer magában foglalja a cDNS PCR-rel történő amplifikációját. Ez a technika könnyen szabványosítható kevésbé kifinomult laboratóriumokban. Információt nyújt a génexpresszióról, valamint előzetes adatokat szolgáltat a hibás komponens mRNS szerkezetéről vagy méretéről. Az RT-PCR-t ritkán alkalmazták a CGD kutatásában, korlátozva patofiziológiai vizsgálatok (15-29). A mai napig ennek a hasznos eszköznek a lehetséges felhasználása az X-hez kapcsolt CGD végleges diagnózisának megállapításához, a leggyakoribb forma, nem vizsgálták alaposan. Jelen tanulmány célja az volt, hogy értékelje az RT-PCR alkalmazását az X-kapcsolt CGD-ért felelős molekuláris hibák szűrésére, ritka és esetleg tévesen diagnosztizált immunhiány, nyolc Brazil betegnél.
betegek és módszerek
betegek
a vizsgálatba 8, nem kapcsolódó, X-hez kapcsolódó CGD-ben szenvedő brazil férfi beteget vontak be (2 fekete és 6 fehér bőrű, 2-8 éves, 88-108 cm magas, 11-19 kg súlyú). A betegek klinikai kórtörténetében visszatérő súlyos fertőzések, például tüdőgyulladás, lymphadenitis, májtályog, pyodermitis, valamint a BCG immunizálás mellékhatásai szerepeltek. A biokémiai és molekuláris diagnosztikai laboratóriumunkba irányították őket. Írásbeli tájékozott beleegyezést kaptak a résztvevőktől a vizsgálat előtt. Az orvosi iskola Etikai Bizottsága a Helsinki egyezménynek és a Brazil Egészségügyi Minisztérium 196/96.sz. határozatának megfelelően jóváhagyta a jegyzőkönyvet.
a CGD biokémiai diagnózisa
a CGD biokémiai diagnózisát a Pan American csoport immunhiányos kritériumok szerint állapították meg. A NADPH-oxidáz aktivitás károsodását az NBT slide teszttel és/vagy a szuperoxid anion felszabadulási teszttel igazolták perifériás vér neutrofilek és mononukleáris leukociták (14,30,31). A neutrofileket és a mononukleáris leukocitákat a vérminták ficoll-Hypaque sűrűséggradienssel történő centrifugálásával nyertük (32).
az NBT slide teszt az NBT formazánná történő redukcióján alapult aktivált leukociták által (31). A vizsgálatot a korábban leírtak szerint végeztük (30). A 95 nM-es phorbol 12-mirisztát 13-acetáttal (PMA) stimulált 200 normál neutrofil több mint% – ának képesnek kell lennie az NBT csökkentésére. A hiányzó reakció vagy <5% pozitív sejt a CGD diagnózisát jelezte (14).
a neutrofilek és mononukleáris leukociták kvantitatív szuperoxid-felszabadulását módosított szuperoxid-diszmutáz-gátló citokróm c redukciós vizsgálattal (33-35) értékelték. A felszabadult szuperoxid mennyiségét 0,21 nM/cm kihalási együtthatóval számítottuk ki a citokróm c esetében. az eredményeket nmol szuperoxidként jelentik, amelyet 106 sejt / óra szabadít fel. A CGD-ben szenvedő betegek a kontroll értékek kevesebb mint 10% – át mutatták.
az X-kapcsolt CGD-ért felelős molekuláris defektusok szűrése
az X-kapcsolt CGD-s betegek B-limfocitáit in vitro átalakítottuk Epstein B vírussal (EBV) (15,16) annak érdekében, hogy a molekuláris vizsgálatokhoz bőséges nukleinsavforrást biztosítsunk. Az EBV-transzformált B-sejtvonalak reprodukálják a CGD betegek biokémiai és molekuláris hibáit (15,16,36), és kiküszöbölik az ismételt vérvétel szükségességét. Röviden, Az X-kapcsolt CGD-s betegek perifériás vér leukocitáit B95-8 felülúszókkal tenyésztettük, egy EBV-termelő sejtvonalból (15,16,36,37), rpmi 1640 táptalajban, hő-inaktivált magzati szarvasmarha szérummal (10%), 2 mM L-glutaminnal, 100 E/ml penicillinnel és 100 db/ml sztreptomicinnel kiegészítve, 37 Kb-on, párás légkörben, 5% CO2-vel. A sejtek életképességét monitorozták, és a tenyészeteket a vizsgálat teljes időtartama alatt fenntartották.
az EBV-transzformált B-sejtvonalakból származó RNS-mintákat guanidin-HCl módszerrel állítottuk elő, majd etanolos kicsapással és standard módszerekkel történő mennyiségi meghatározással (38,39). A cDNS mintákat 2 db teljes RNS reverz transzkripciójával nyertük, felső index II RT-vel (GIBCO BRL) és random hexamer-ekkel (15). Az mRNS minták minőségét a konstitutív génkontroll (BP 920-943 és bp 1494-1471) (Gen Bank csatlakozási sz. NM001101).
a gp91-phox gén expresszióját RT-PCR-rel értékeltük. Specifikus és egymást átfedő primerpárok (Gen Bank csatlakozási szám. NM_000397, 1. táblázat) három gp91-phox exonikus régió (1-5, 3-9 és 7-13) felerősítésére használták. Ez a stratégia lehetővé tette számunkra az összes gp91-phox exon szűrését. A PCR termékeket 2% – os agarózgél-elektroforézissel elemeztük, majd etidium-bromiddal festettük.
a relatív gp91-phox génexpressziót az Image Master szoftverrel (Pharmacia-Biotech) elemeztük. A célminták denzitometriás eredményét elosztottuk a denzitometriás eredményével 6-aktin, konstitutív génkontroll, normalizálva az elemzéshez figyelembe vett szintet. Az RT-PCR vizsgálatok eredményeit összehasonlították a beteg klinikai kórtörténetével, biokémiai vizsgálatokkal (NBT és/vagy szuperoxid felszabadulási vizsgálat) és a rendelkezésre álló mutációs analízis adatokkal (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ index.htm).
eredmények
8 férfi beteget vizsgáltunk, akiknek klinikai kórtörténetében visszatérő súlyos fertőzések fordultak elő, a CGD biokémiai és molekuláris diagnosztizálására szolgáló laboratóriumunkba. Az NBT slide tesztek és a szuperoxid felszabadulási vizsgálatok eredményeit a 2.táblázat mutatja. A betegek közül hat kevesebb, mint 5% pozitív leukocitát mutatott be az NBT slide tesztben. Hat betegnél a granulocyták és/vagy mononuclearis leukocyták szuperoxid-felszabadulása csökkent (kevesebb mint 10% az egészséges kontrollokhoz képest). Négy beteg kóros eredményeket mutatott mindkét tesztben. Minden betegnél legalább egy abnormális tesztet mutattak, és megkapták a valószínű X-kapcsolt CGD diagnózisát. A T. B. P. beteg anyja és nővére egy NBT slide tesztet mutatott be, amely kompatibilis az X-kapcsolt CGD hordozó státusával. A vizsgálati időszak alatt egy beteg (G. M.) tüdőgyulladásban halt meg.
ezután az X-kapcsolt CGD végleges diagnózisát vizsgáltuk a gp91-phox génexpresszió RT-PCR elemzésével. Az RT-PCR amplifikáció eredményeit három egymást átfedő primerkészlettel a 2. táblázat mutatja be. Az mRNS-minta minőségét a konstitutív génkontroll, a DNS-aktin PCR-amplifikációjával ellenőriztük. Ebben az esetben megkaptuk a várt normál termékeket (1., 2. és 3. ábra).
négy esetben lehetséges volt az RT-PCR adatok összevetése a rendelkezésre álló mutációs analízissel, amelyet másutt mutatott be a Pati ons et al. (30) vagy csoportunk ( //www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. bemutatott egy C469-es T-átmenetet az 5. exonban, megjósolva egy nonszensz mutációt (R157X). M. F. nonszensz helyettesítést mutatott be a 3. exonban, R (arginin)73-Stop. R. S. 264 G A-S helyettesítést mutatott a gp91-phox 3. exon 3 ‘ splice csomópontjában. A cDNS-szekvencia a gp91-phox 3. exon delécióját mutatta, ami instabil vagy nem funkcionális mutáns gp91-phoxot eredményezett. G. G. a gp91-phox 3 exon hibás illesztését mutatta be (az alapul szolgáló mutációt még nem határozták meg). A többi beteget továbbra is vizsgálják.
összességében ez a stratégia lehetővé tette a hibás gp91-phox expresszió kimutatását nyolc beteg közül hétben. Az RT-PCR eredmények megfeleltek a klinikai anamnézisnek, a biokémiai adatoknak (NBT vagy szuperoxid felszabadulási teszt) és a rendelkezésre álló mutációs elemzésnek négy esetben. Három további esetben az RT-PCR eredmények megfeleltek a klinikai anamnézisnek és a biokémiai adatoknak. Egy másik esetben az RT-PCR normális volt annak ellenére, hogy a klinikai kórtörténet kompatibilis a CGD-vel, egy hibás légzési burst, amelyet az NBT teszt és a szuperoxid felszabadulási teszt jellemez, valamint az anyja és nővére NBT tesztjei kompatibilisek az X-kapcsolt CGD hordozó státusszal.
Vita
ez a cikk 8 Független brazil férfi beteg biokémiai és génexpressziós vizsgálatáról számol be, akiknek klinikai kórtörténetében CGD szerepelt, akiket laboratóriumunkba irányítottak részletes vizsgálat céljából. A CGD egy ritka örökletes rendellenesség, amelyben a fagocita sejtek nem képesek szuperoxid aniont és más reaktív oxigén intermediereket előállítani. A valószínű X-kapcsolt CGD diagnózisát kezdetben biokémiai módszerekkel, például NBT slide tesztekkel és/vagy szuperoxid anion felszabadulási tesztekkel állapítottuk meg. Eredményeink azt mutatták, hogy minden beteg károsodott NADPH-oxidáz funkciót mutatott, viszont valószínű X-kapcsolt CGD.
mindkét módszer különböző módon járul hozzá a CGD valószínű diagnózisához. Az NBT slide teszt információt nyújt azon sejtek számáról, amelyek az NBT-t formazánná redukálják a citoplazmában, valamint ennek a redukciónak az intenzitásáról. Így az X-kapcsolt CGD variáns formáival rendelkező betegek rendellenes NBT diateszteket mutatnak, amelyekben a sejtek többsége gyengén redukálja az NBT-t formazánná. Az NBT slide teszt az X-kapcsolt CGD női hordozóit is kimutatja. A szuperoxid felszabadulási teszt a citokróm c redukcióját méri a reakcióban jelen lévő aktivált leukociták által termelt szuperoxiddal, lehetővé téve az X-kapcsolt CGD variáns formáinak diagnosztizálását. Mindkét teszt könnyen szabványosítható alacsony komplexitású laboratóriumokban, és egyik sem igényel drága berendezéseket. A dihidrorhodamin 123 teszt nagyon érzékeny módszer a CGD biokémiai diagnosztizálására; azonban áramlási citométert igényel, nagyon drága eszköz.
értékeltük gp91-phox génexpresszió EBV-transzformált B limfocitákban CGD-s betegekből RT-PCR elemzéssel. Specifikus és egymást átfedő primerpárokat használtak a gp91-phox gén három régiójának RT-PCR-rel történő amplifikálására: 1-5, 3-9 és 7-13 exonok. Ez a stratégia lehetővé tette a hibás gp91-phox expresszió kimutatását 7 nak, – nek 8 betegek. Az RT-PCR eredmények megfeleltek a klinikai anamnézisnek, a biokémiai adatoknak (NBT vagy szuperoxid felszabadulási teszt) és a rendelkezésre álló mutációs elemzésnek négy esetben. Három további esetben az RT-PCR eredmények megfeleltek a klinikai anamnézisnek és a biokémiai adatoknak.
a gp91-phox génexpresszió csökkent az R. B. beteg összes exonikus régiójában.ez a csökkenés olyan mutációk eredménye lehet, amelyek alacsony RNS-stabilitáshoz vagy megváltozott transzkripciós aktivitáshoz vezetnek. Betegek G. M. és T. P. a 7-13 exonok hiányzó expresszióját mutatta, ami arra utal, hogy ezeknek a további 3′-végű exonoknak a csökkent expressziója RNS instabilitás vagy splicing hiba következménye lehet, pl. részben helyes splicing jel előállításához, de részben abnormális splicing a primer kötőhelyének kiküszöbölésére, amelyet a jövőben meg kell vizsgálni genomi DNS mutációs elemzések.
G. G. beteg diffúz, alacsony abundanciájú, az 1-5 exonok kisebb méretű termékét mutatta be (1.ábra), és más exonikus régiók expressziója hiányzott. A mutáció elemzése hibát mutatott a 3.exon illesztési helyén. Hasonlóképpen, az R. S. beteg mutációs elemzése hibát is feltárt a 3. exon illesztési helyén. Ebben az esetben azonban kevésbé bőséges PCR-terméket lehetett kimutatni.
M. F. beteg a 3-9 és a 7-13 exonikus régiók csökkent expresszióját mutatta, ami a 3.exon hibás transzkripciós aktivitásának eredménye lehet. J. E. M. nonszensz mutációt mutatott be az 5. exonban, amely a gp91-phox expresszió elvesztését eredményezte, amint azt az RT-PCR elemzés is bizonyítja, amely a nonszensz által közvetített mRNS instabilitás lehetséges következménye.
egy esetben a beteg T. P. B. a gp91-phox gén expressziója normális volt, annak ellenére, hogy a családi anamnézis kompatibilis a CGD-vel és a hibás légzési burst aktivitással. Ebben az esetben a valószínű X-kapcsolt CGD diagnózisa az anyjánál és a nővérénél végzett abnormális NBT teszteken alapult, amelyek kompatibilisek a hordozó státusszal. Feltételezzük, hogy ebben a konkrét esetben meg kell vizsgálni egy pontmutációt, például egyetlen bázis szubsztitúciót, amely nem változtatja meg a PCR fragmens hosszát vagy bőségét.
az RT-PCR hatékony eszköz a génexpresszió értékelésére. Ez a jellemző részben megmagyarázhatja a gp91-phox génexpresszió variabilitását a vizsgálatba bevont betegek körében, valamint az átfedő primerpár kombinálásának fontosságát az üzenet teljes hosszának szűrésére. Az RT-PCR-t izolált esettanulmányokban alkalmazták a CGD különböző formáinak kezdeti diagnózisának részeként (17-22). Az RT-PCR analízis hasznos volt a P47-phox hiányból eredő CGD prenatális diagnózisában is (23). Azonban gyakrabban használták a NADPH-oxidáz komponensek génszabályozásának tanulmányozására különféle sejtekben (15,16,24-29). A mai napig ennek a hasznos eszköznek a lehetséges felhasználása az X-hez kapcsolt CGD végleges diagnózisának megállapításához, a leggyakoribb forma, nem vizsgálták alaposan. További vizsgálatokat kell végezni a vizsgálat érzékenységének és specificitásának összehasonlítására más komplex vizsgálatokkal, például nyugati vagy északi blotokkal.
összességében bebizonyítottuk, hogy az RT-PCR, egy egyszerű és alacsony költségű módszertan, az X-kapcsolt CGD végleges diagnózisát 7-ből 8 esetben hozta létre, anélkül, hogy bonyolult és drága módszereket kellene alkalmazni, mint például az Északi blot, a slot blot, az SSCP elemzés vagy a genomi DNS szekvenálás. Így az RT-PCR megfelelő eszköz lehet a CGD diagnosztizálására a fejlődő országok laboratóriumaiban. Nagyon fontos meghatározni a végleges molekuláris genetikai hibát annak érdekében, hogy megfelelő genetikai tanácsadást és prognózist biztosítsunk a CGD-vel rendelkező rokonoknak. Ezenkívül az emberi NADPH-oxidáz rendszer molekuláris genetikai vizsgálata elősegíti a tudást erről a létfontosságú és ősi védelmi mechanizmusról.
2. Leszállás BH & Shirkey HS (1957). Visszatérő fertőzés és a zsigerek pigmentált lipid histiocyták általi infiltrációja. Gyermekgyógyászat, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey R & Stokstad ELR (1975). A szelén hatása a csibék exudatív diatezisének megelőzésére. A kísérleti biológiai és Orvostudományi Társaság folyóiratai, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Forehand JR, Axtell RA, Roberts RL & Johnston Jr RB (1988). A krónikus granulomatosus betegség klinikai jellemzői és jelenlegi kezelése. Észak-Amerika hematológiai/onkológiai klinikái, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993). Krónikus granulomatózus betegség: klinikai rejtvény megoldása molekuláris szinten. Klinikai immunológia és immunopatológia, 67: S2-S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, Barna R, Jesaitis aj & Parkos CA (1987). Az X-kapcsolt krónikus granulomatózus betegség lokusza által kódolt glikoprotein a neutrofil citokróm B komplex egyik alkotóeleme. Természet, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi H, Volpp BD, Pearson DW, Nauseef WM & Curnutte JT (1989). A krónikus granulomatózus betegség genetikai változatai:a NADPH-oxidáz rendszer két citoszolos komponensének hiányosságai. New England Journal of Medicine, 321: 647-652.
10. Kereszt AR, Noack D, Rae J, Curnutte jt & Heyworth PG (2000). Hematológiailag fontos mutációk: a krónikus granulomatózus betegség autoszomális recesszív formái (első frissítés). Vérsejtek, molekulák és betegségek, 26: 561-565.
11. Smith RM & Curnutte JT (1991). A krónikus granulomatózus betegség molekuláris alapja. Vér, 77: 673-686.
12. Magánhangzók SJ, Fleisher TA, Sekhsaria S, Alling DW, Maguire te & Malech HL (1996). Krónikus granulomatosus betegségben szenvedő betegeknél a csökkent nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-oxidáz funkció áramlási citometriájának genotípusfüggő variabilitása. Gyermekgyógyászati folyóirat, 128: 104-107.
15. Condino-Neto a & Newburger PE (1998). NADPH oxidáz aktivitás és a humán Epstein-Barr vírus citokróm b558 tartalma transzformált B limfociták korrelálnak az oxidáz rendszer komponenseit kódoló gének expressziójával. Biokémiai és biofizikai Levéltár, 360: 158-164.
16. Condino-Neto a & Newburger PE (2000). Az Interferon-gamma javítja a cybb gén transzkriptumainak splicing hatékonyságát az X-hez kapcsolt krónikus granulomatózus betegség interferonra reagáló változatában a splice hely konszenzus régió mutációja miatt. Vér, 95: 3548-3554.
19. Bonizzato a, Russo MP, Donini M & Dusi S (1997). Kettős mutáció (D160V-K161E) azonosítása egy krónikus granulomatózus betegségben szenvedő beteg p67phox génjében. Biokémiai és biofizikai kutatási kommunikáció, 231: 861-863.
21. Noack D, Heyworth PG, Newburger pe & kereszt AR (2001). Szokatlan intronikus mutáció a CYBB génben, amely krónikus granulomatózus betegséget okoz. Biochimica et Biophysica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler J, Curnutte JT, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock SJ & Goerlach A (2000). A p47-phox gén és erősen homológ pszeudogénjei közötti rekombinációs események az autoszomális recesszív krónikus granulomatosus betegség fő okai. Vér, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Prenatális diagnózis két családban autoszomális, p47(phox)-hiányos krónikus granulomatózus betegség az ncf1 új pontmutációja miatt. Prenatális Diagnózis, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff s & Bringas P (1999). NADPH fagocita oxidáz komponensek fejlődési expressziója egér embriókban. Gyermekkutatás, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Élvonalbeli: az emberi granulocita ehrlichiosis kórokozója által okozott fertőzés megakadályozza a légzésrobbanást a gp91phox lefelé szabályozásával. Immunológiai folyóirat, 164: 3946-3949.
26. Bayraktutan U, Blayney L & Shah AM (2000). A NAD(P)H oxidáz komponensek gp91-phox és p22-phox molekuláris jellemzése és lokalizációja az endothel sejtekben. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese RM, Gallin JI & Lomax KJ (1992). Rekombináns p47phox fehérje retrovírus expressziója Epstein-Barr vírus által transzformált B limfociták autoszomális krónikus granulomatózus betegségben szenvedő betegből. Vér, 79: 1829-1835.
28. Gorlach A, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M, Dehghani F & Busse R (2000). Az endothel sejtekben szelektíven expresszált NADPH-oxidázt tartalmazó gp91phox az oxigéngyökök egyik fő forrása az artériás falban. Cirkulációs Kutatás, 87: 26-32.
29. Rouzaut A, Lopez-Moratalla n & de Miguel C (2000). Differenciális génexpresszió az emberi monociták aktiválásában és érésében. Biokémiai és biofizikai Levéltár, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). Az NBT slide teszt: egy egyszerű szűrési módszer a krónikus granulomatózus betegség és a női hordozók kimutatására. Gyermekgyógyászati folyóirat, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Mononukleáris sejtek és granulociták izolálása emberi vérből. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 21 (Suppl 97): 1-77.
33. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1993). A krónikus granulomatózus betegségben szenvedő betegek neutrofiljei és mononukleáris sejtjei nitrogén-monoxidot bocsátanak ki. Brit Klinikai Farmakológiai folyóirat, 35: 485-490.
35. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1996). A rekombináns humán gamma-interferon terápia hatása a neutrofil és mononukleáris sejtek nitrogén-monoxid felszabadulására krónikus granulomatózus betegségben szenvedő betegeknél. Interferon és citokin kutatási folyóirat, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin JI & Fauci AS (1984). B-sejtvonalak mint öröklött fagocita betegségek modelljei: szuperoxid-termelés krónikus granulomatózus betegségben és granulátum Chediak-Higashi szindrómában. Immunológiai folyóirat, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Henle W & Henle G (1971). Lymphoblastoid sejtvonalak létrehozása felnőtt és magzati humán limfoid szövetből és az EBV-től való függése. Nemzetközi rákos folyóirat, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger PE & Weissman SM (1999). Módosított módszer a cDNS-EK 3′ – végű restriciton fragmenseinek megjelenítésére: a génexpresszió molekuláris profilozása neutrofilekben. Módszerek az Enzimológiában, 303: 272-297.
Köszönetnyilvánítás
a szerzők köszönetet mondanak a betegeknek és családjaiknak a részvételért és a segítségért, valamint Silvana Severino nővérnek a technikai segítségért. A szerzők köszönetet mondanak Peter Newburger professzornak, a massachusettsi Egyetem Orvostudományi Karának a kézirat kritikai áttekintéséért.
levelezés és lábjegyzetek