az elsődleges sejtek, különösen az ős/progenitor populációk izolálása és hosszú távú terjeszkedése alapvető és fontos alapvető technikák a különböző biológiai területeken, beleértve a fejlődésbiológiát és az őssejtbiológiát, valamint az orvostudományt. A rétegzett és oszlopos hámszövetekben lévő sejtek nagymértékben regenerálódnak és aránytalanul felelősek számos emberi rákért; a felnőtt őssejtek klónozását azonban korlátozzák a sejtek éretlen állapotban tartásának nehézségei. Az elmúlt években a technikai újítások gyors és drámai haladást eredményeztek az őssejtbiológiában, mint például a kis molekulák és növekedési faktorok használata a szöveti niche környezet utánzására és az “Organoid kultúra” megkönnyítésére .
1975-ben Rheinwald és Green megalapították az emberi keratinociták felhasználásával végzett felnőttkori őssejtkultúra első sikeres példáját . Pontosabban, hosszú távon fenntartották az emberi keratinocitákat egy szubletálisan besugárzott egér fibroblaszt sejtvonallal, 3T3-J2-vel kombinálva. Bár nem használták az “őssejtek” kifejezést a 3T3 sejteken termesztett klónozott keratinocitákra, Green és kollégái olyan kolóniákat találtak, amelyek figyelemre méltó képességgel rendelkeznek arra, hogy áthaladás után új kolóniákat alkossanak, amelyeket “Holoklonoknak” neveztek . Ezek a holoklonok kicsiből állnak, éretlen sejtek, amelyek mindegyike intenzív magfestést mutatott p63-mal, a törzs fő szabályozója, rétegzett hámsejtekben . A stratifikált epitheliumban, beleértve a bőrt, a tüdő bronchiát, az emlőmirigyet és a húgyhólyag urotheliumot, az őssejtpopuláció főként a bazális rétegben lokalizálódott, és az éretlen sejteket P63-mal festették, összhangban az in vitro vizsgálatokkal . Az autológ bőrből izolált és expandált humán keratinocitákat sikeresen beoltották a betegek elégetésére, és regeneráltak egy állandó epidermist, amely hasonlít a hasított vastagságú bőrátültetések eredményére . Nevezetesen ugyanezt az eljárást alkalmazták az emberi szaruhártya hámsejtjeinek izolálására és kiterjesztésére transzplantáció céljából . Bár ez a technológia akkoriban az epidermisz és a szaruhártya őssejtjeire korlátozódott, Green és kollégái megalapozták az emberi felnőtt őssejtek klónozását az alapvető biológia és a regeneratív orvoslás területén.
ebben az áttekintő cikkben áttekintést nyújtunk a legújabb kutatások előrehaladásáról és a sejttenyésztési rendszer bizonyítékainak összegyűjtéséről, amelyek technikai áttörésekhez vezettek a hámsejt-technológiákban. Az új tenyésztési stratégiák mind a rétegzett hámsejtekre, mind az oszlopos hámsejtekre lehetővé tették az emberi hámfejlődés összefoglalását, és felhasználhatók egy humán betegség modell in vitro előállítására. Megvitatjuk a normál hámsejt-tenyésztési technológiák lehetséges és lehetséges alkalmazásait a regeneratív gyógyászatban, és kiemeljük a rákos sejtkultúra rendszert, amely reprodukálja az egyes betegek fenotípusait.
rétegzett hámsejtkultúra
a rétegzett hámszövetekben, beleértve a mirigyeket és a pszeudostratifikált hámsejteket is, a P63+ sejtek, amelyek az alapmembránon helyezkednek el, önmegújulhatnak, hogy fenntartsák az ős/progenitor populációkat, és utódokat hozzanak létre, amelyek funkcionális szöveteket képeznek . Mint már említettük, az epitheliális őssejtek, például a bőr keratinocyták és a szaruhártya epitheliális sejtjeinek klónozása és expanziója jól megalapozott a besugárzott egér 3T3-J2 fibroblasztokkal végzett Ko-tenyésztési rendszerekben. Ez a standard protokoll azonban nagyrészt a keratinociták és a szaruhártya sejtek hosszú távú tenyésztésére korlátozódott. Ennek ellenére a timikus hámból származó klónozott őssejtekről számoltak be, csakúgy, mint a timikus hámsejtek izolálása különféle fajokból, beleértve az emberi sejteket is, 3T3 adagolórendszerrel tenyésztve . Továbbá Frey és kollégái a közelmúltban alkalmazták a 3T3 feeder módszert az urothelialis őssejtek izolálására, amelyek sonic hedgehog-ot expresszáltak és a húgyhólyag urothelium bazális rétegében tartózkodtak . Ezeket az izolált humán és sertésszövetből származó urothelialis őssejteket stabilan tenyésztették egy 3T3 feeder rétegen, és képesek voltak több sejtvonalat létrehozni, beleértve a P63+ bazális sejteket és az Uroplakin 2+ és 3+ urothelialis sejteket meztelen egerekben végzett vesekapszula-transzplantáció után. 2011-ben Pooja et al. a 3T3 tenyésztési rendszert háromféle emberi légúti hámsejt izolálására használták fel, azaz. ezek a légúti epitheliális őssejtek különálló sejtfenotípusokat mutattak az in vitro differenciálódás után, bár az éretlen őssejt-klónok morfológiailag megkülönböztethetetlennek tűntek (ábra. 1) . Egy követéses vizsgálatban egér trachealis és distalis légúti epitheliális őssejtek transzplantációja kimutatta, hogy a distalis légúti őssejtek könnyen beépülnek a H1N1 influenza által károsított tüdőszövetbe, és több epitheliális sejttípusra differenciálódnak, pl., bronchiolák és alveolusok, míg az átültetett trachealis őssejtek csak a fő légutakban lokalizáltak . A klonogén őssejteket humán nyelőcső endoszkópos biopsziás mintákból is izolálták, és ezek a sejtek képesek voltak jól differenciált, rétegzett laphámhámszerű struktúrákat kialakítani egy Air liquid interface (ALI) tenyésztési rendszerben .
Schlegel és munkatársai arról számoltak be, hogy egy Rho-asszociált protein-kináz (ROCK) inhibitor a 3T3 feeder sejtekkel kombinálva jelentősen növelte az epitheliális őssejtek proliferációs képességét, beleértve az emberi keratinocitákat, a prosztata sejteket és az emlőmirigy sejteket, és ezt a jelenséget “feltételes újraprogramozásnak” nevezték . A betegek epitheliális őssejtkultúráinak hatékony előállítása kritikus és értékes betekintést nyújt a sejtalapú diagnosztikába és terápiákba . Újabban Rajagopal és munkatársai kimutatták, hogy a TGF/BMP/SMAD jelátviteli út fontos a különböző hámszövetekben, beleértve az ektoderma eredetű bőr-és emlőmirigy szöveteket, az endoderma eredetű nyelőcső-és prosztata szöveteket, valamint a Mezoderma eredetű epididymist. Felfedezték, hogy az SMAD jelátvitel kettős gátlása (a BMP jelet a DMH-1 blokkolta, a TGF-et pedig a-83-01 gátolta) elősegítette az emberi és egér epitheliális bazális sejtpopulációk stabil szaporodását. Meglepő módon a kettős TGF / BMP gátlás lehetővé tette az epitheliális őssejtek robusztus terjeszkedését egér 3T3 feeder sejtek nélkül.
ezek a technikai előrelépések kis molekulákkal és feeder sejtekkel kombinálva felhasználhatók a rétegzett hámsejtek/progenitor populációk in vitro folyamatos és hatékony kiterjesztésére. Egy másik áttörés a rétegzett hámkultúrában, organoid kultúra, mind a bazális, mind a luminális humán prosztata progenitorok kibővítésére használták. Ezek a humán luminalis progenitorok multipotensek voltak, és in vitro prosztata mirigyszerű struktúrákat alakítottak ki . Ugyanakkor továbbra is kihívást jelent a rétegzett vagy pszeudostratifikált hámokból álló háromdimenziós struktúrák létrehozása az autentikus in vivo építészet megismétlése érdekében, bár sok kutató beszámolt szferoid és organoid kultúrákról. Ezt a problémát úgy lehet megoldani, hogy létrehozunk egy módszert az önszerveződés megkönnyítésére, amint azt pluripotens őssejtből származó szövetekben végezzük.
oszlopos epiteliális sejttenyészet
bár a bél őssejtjei figyelemre méltó képességgel rendelkeznek, hogy nagy forgalom mellett szaporodjanak a bélhám fenntartása érdekében, és a májsejtek a károsodásra reagálva erősen regenerálódnak, az oszlopos hámsejtekből származó őssejtpopulációk klónozásának képessége súlyosan korlátozott, feltehetően a szöveti niche jelek hiánya miatt in vitro. Az elmúlt évtizedben Clevers és kollégái felfedezték az lgr5-öt (leucin-rich repeat-contained G-protein coupled receptor 5), egy intesztinális őssejt markert egy kifinomult egérmodellben (LGR5-EGFP-ires-CreERT2 egerek keresztezték a CRE-aktivált Rosa26 LacZ riporterrel), és létrehoztak egy egér intesztinális organoid tenyésztési módszert, amely villus-szerű struktúrákból és kripta-szerű zónákból áll, több intesztinális sejttípussal . Növekedési faktorokkal és kis molekulájú koktélokkal kombinálva egy izolált LGR5+ őssejt frakciót felfüggesztettek Matrigelben, és hosszú távon tenyésztették . A tenyésztési állapot módosításával nikotinamid, egy p38 és TGF receptor inhibitor alkalmazásával a vékonybélből és a vastagbélből izolált humán hámsejtek hosszú távon képesek voltak végtelen mértékben kitágulni in vitro . Ez a technika alkalmazható más típusú sejtek, például hasnyálmirigy-csatorna sejtek és hepatociták tenyésztésére, és elősegítette az oszlopos epiteliális sejttenyészet forradalmi fejlődését.
az Organoid tenyésztés Matrigel-alapú 3D-s tenyésztési platformot alkalmaz, és széles körben alkalmazható a felnőtt hámsejtek különböző típusainak stabil tenyésztésére, beleértve a rétegzett hámsejteket is, ős – /progenitor sejtpopulációkkal . Ugyanakkor az egységes őssejtek egy részének gyors és hatékony szaporításának képessége in vitro szintén hasznos és fontos a szöveti őssejtekben az önmegújulás és a sors specifikációjának részletes vizsgálatához, valamint a regeneratív gyógyászatban a sejtátültetés lehetséges jövőbeli alkalmazásaihoz. Xian és munkatársai nemrégiben kifejlesztettek egy új tenyésztési rendszert az emberi magzati intesztinális őssejtek, köztük a vékonybél és a vastagbél sejtek homogén expanziójára. Ez a rendszer 3T3 egéradagoló réteget alkalmazott növekedési faktorokkal és jelút inhibitorokkal kombinálva az emberi oszlopos hámsejtek erőteljes kibővítésére (ábra. 1) . Ezenkívül a 3T3 fibroblasztokon termesztett bél őssejtek több mint 50% – a képes kolóniákat képezni. Az emlős belekben meghatározott niche faktorok, mint például a Wnt és a Notch jelek, elengedhetetlenek a bél őssejtjeinek a kripta alapjában lévő őssejtjeinek szabályozásához. Ezenkívül a Paneth sejtek, amelyek szintén a kripta bázisán helyezkednek el, őssejtekből származnak, és őssejt-résként működnek azáltal, hogy alapvető tényezőket biztosítanak parakrin módon. Mivel az organoid tenyészetek őssejtekből és különböző származékokból, például Paneth sejtekből állnak, a niche faktorok önállóan vannak ellátva . Ezzel szemben, mivel a bél őssejtjeinek tiszta populációját 3T3 feeder rétegen termesztik, a sejtek nem tudnak szekretálni niche faktorokat. Ezért ki kell egészíteni a réstényezőkre emlékeztető külső tényezőket. Az őssejt-fenntartási protokoll mellett egy differenciálási protokollt is létrehoztak egy ALI tenyésztési modellben, hogy legalább négyféle fő bélsejtet, azaz Paneth-sejteket, entero-endokrin sejteket, serlegsejteket és enterocitákat (bélelnyelő sejteket) hozzanak létre . Az intesztinális villus-szerű struktúrák kialakulását az eredeti szövettípusok, például a vékonybél és a vastagbél szövetei szerint figyelték meg (ábra. 1). Egy másik ALI kultúra megközelítés, Kuo és munkatársai robusztus tenyésztett kis darab egér újszülött bél egy stromális elem hosszú távú .
ugyanezt a stratégiát alkalmazták az endoszkópos biopsziából nyert emberi gyomor őssejtek klónozására is. Pontosabban, a klonogén gyomorsejteket stabilan kibővítették egy 3T3 feeder rétegen növekedési faktorokkal és kis molekulákkal kombinálva, és a gyomor epitheliális vonalaiba differenciálódtak, amelyek általában a gyomorban találhatók, mint például a pepszinogén-expresszáló fősejtek . A klónozott emésztőszervi őssejtek mellett a disztális méhcsőből származó petesejt progenitor sejtek is képesek voltak végtelenül szaporodni egy 3T3 feeder rétegen niche faktorok jelenlétében . A disztális petevezeték, a fimbria hám, egy egyszerű oszlopos hámréteg, amely a következő két sejttípusból áll: csillós sejtek, amelyek fokozzák az ivarsejtek szállítását, valamint szekréciós sejtek, amelyek nyálkát választanak ki. A bél őssejtek differenciálódási protokolljának enyhe módosításával a hosszú távú ALI-tenyésztett oviductalis őssejtek 3D architektúrát eredményeztek, amely mind csillós, mind szekréciós sejteket tartalmazott, ami az in vivo epithelium szerkezetére emlékeztetett . Az a képesség, hogy az őssejtpopulációból megfelelő sejttípusú epitheliális vonalakat állítsanak elő, hasznos eszköz lehet a fiziológiás epitheliális fejlődés és homeosztázis tanulmányozására, valamint akut és krónikus betegségmodellek kifejlesztésére in vitro.
rákos sejtkultúra
mivel az első rákos sejtvonalat, a HeLa sejtvonalat 1951-ben egy méhnyakrákos betegből hozták létre, a ráktípusok széles köréből létrehozott rákos sejtvonalakat széles körben használják a rák patobiológiájának tanulmányozására , és lehetőséget nyújtottak in vivo xenograft modellek előállítására és rákellenes gyógyszerek tesztelésére in vitro és in vivo. Bár óriási előrelépések történtek a rákbiológiában a rákos sejtvonalak felhasználásával, az ezekkel a sejtekkel kapott eredmények nem feltétlenül tükrözik kellőképpen a betegség összetettségét az eredetileg vártnak megfelelően, mivel a rák interpatiens és intratumor heterogenitást mutat, amint azt a következő generációs szekvenálás legújabb fejleményei feltárják . Annak érdekében, hogy pontosabban tükrözze a rák fenotípusait, beleértve a beteg génmutációs állapotát és patológiáját, Welm és munkatársai kifejlesztették a mellrák betegből származó xenograft (PDX) modelljeit nonobese diabéteszes súlyos kombinált immunhiányos (NOD-SCID) egerekben, amelyek fenntartották az eredeti daganatok alapvető jellemzőit, és metasztatikus kapacitást mutattak bizonyos helyeken . A mellrák modell mellett a különböző típusú szilárd daganatok létrehozása bizonyította a PDX modellek megvalósíthatóságát, amelyek várhatóan felgyorsítják az új rákterápiák preklinikai tesztelését és segítenek a “személyre szabott orvoslás”céljának megvalósításában.
a felnőtt őssejtek tenyésztési módszerei, mint például az organoid és a feeder rendszerek, szintén alkalmazhatók a betegből származó rákos sejteket használó különböző megközelítésekre. Clevers és kollégái arról számoltak be, hogy az organoid kultúra felhasználható a hasnyálmirigy , a prosztata és a vastagbélrák modellezésére , és megmutatta, hogy az eredeti rákos tulajdonságok, beleértve a genetikai heterogenitást és a gyógyszerérzékenységet, összefoglalhatók. Ezért ezt a rendszert “élő organoid biobanknak”nevezték. Ezek a technológiák felhasználhatók egy őssejtpopuláció izolálására egy rákmegelőző elváltozásból, például Barrett nyelőcsőjéből, az emberi nyelőcső adenokarcinóma prekurzorából . Az izolált és expandált Barrett-nyelőcső őssejteket SV40 Nagy t antigén, hTERT és c-myc és xenograft bevezetésével alakítottuk át immunhiányos NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) egerekbe . Ahogy az várható volt, Barrett nyelőcső őssejtjei egerekben nyelőcső adenokarcinóma-szerű daganatokká alakultak át. Hasonló megközelítés bizonyította, hogy az emberi oviductalis őssejtek voltak a származási sejtek a magas fokú serózus petefészek hámrákban . Ez a megállapítás megerősíti a legújabb emberi patológiát és a transzgenikus egér modell bizonyítékait, amelyek azt mutatták, hogy a disztális oviductalis epithelium a rák származási szövete . A CRISPR/Cas9 rendszerrel kombinálva a normál vastagbél őssejteket egymás után transzformáltuk a kolorektális rákban gyakran kimutatott vezető mutációk bevezetésével . A kapott sejtek xenograftokat képeztek a vese kapszulában, és progresszív átalakulást mutattak adenokarcinómaszerű fenotípusokká, amelyeket invazív és metasztatikus tulajdonságok jellemeztek. Összességében a sejtek izolálása és tenyésztése a tumor és a beteg által illesztett normál hámszövetekből megkönnyíti egy olyan platform létrehozását, amely nemcsak kiegészíti a klasszikus in vivo állati munkát a rákbiológia területén, hanem megkönnyíti a betegspecifikus genetikát és a genomikai megközelítéseket in vitro.
gyulladásos betegség modellezése felnőtt őssejtekkel
az emberi betegség modellezését akadályozza az emberi beteg szövetek korlátozott hozzáférhetősége. Mindazonáltal a felnőtt őssejt-termesztés fejlődése lehetővé tette számunkra, hogy in vitro reprodukáljuk a betegség fenotípusait az őssejtek kibővítésével és az érett sejttípusok kis emberi biopsziás mintákból történő levezetésével. Mivel a 3D tenyésztési módszerek, mint például az ALI és az organoid tenyésztés, olyan struktúrákat biztosítanak, amelyek több sejttípusból állnak, és hasonlítanak az in vivo megfigyelt epithelium architektúrára, alkalmasnak kell lenniük gyulladásos betegségek, köztük fertőző és örökletes betegségek tanulmányozására. Pontosabban, a betegség fenotípusának reprodukálása egyszerű, ha a kórokozó (vagy fő oka) és a célzott sejttípus ismert.
a pszeudomembranosus vastagbélgyulladást (PMC) az antibiotikum-kezelés után aránytalanul megnövekedett Clostridium difficile (C. difficile) populáció okozza. A C. difficile egy Gram-pozitív, spóraképző baktérium, amely nagy molekulatömegű tcda és TcdB toxinokat termel, amelyek folyadékszekréciót, gyulladást és vastagbélszövet-károsodást okoznak. Az ALI tenyészetben a klonogén vastagbél őssejtektől differenciált vastagbél hámsejteket ezekkel a toxinokkal támadták meg, amelyek idő – és dózisfüggő módon pusztító hámkárosodást okoztak. Ez az eredmény azt jelezte, hogy a 3D tenyésztési modell felhasználható a C. difficile patológia ábrázolására . Hasonlóképpen, a Helicobacter pylori (H. pylori) fertőzés hatását, amely krónikus gastritist, gyomorfekélyt és rákot okoz, a H. pylori organoid tenyészetekbe történő mikroinjekciózásával vizsgálták. A baktériumokkal fertőzött organoid kultúrák fokozott gyulladást mutattak, mint például az NF-kB aktiváció és az IL8 indukció, és az IL8 expresszió szignifikánsan magasabb volt a mirigy típusú organoid kultúrákban, mint a pit típusú organoid kultúrákban .
felnőtt őssejteket is használtak az örökletes betegség modellezésére. Beekman és munkatársai egy cisztás fibrózisban (CF) szenvedő betegekből származó intesztinális organoid tenyészetet jelentettek. A CF-et a cisztás fibrózis transzmembrán vezetőképesség-szabályozó (CFTR) mutációi okozzák, amely általában számos szerv, például a tüdő és az emésztő szövetek hámsejtjeiben expresszálódik. Bár a normál intesztinális organoid tenyészetek erőteljes duzzanatot mutattak a Forskolin hatására, a duzzadási választ nem figyelték meg a CF organoid tenyészetekben . Sőt, amikor a mutált CFTR lokuszt a CRISPR/Cas9 technológiával korrigáltuk a CF betegek bélszervoidjaiban, a korrigált gének funkcionálisan működtek . Ezért a felnőtt őssejtek in vitro differenciálódása, amely több sejttípusú in vivo fenotípusokhoz hasonlít génszerkesztő technológiákkal kombinálva, hatékony eszközöket biztosít az emberi betegségek kezelésére, és közvetlen betekintést nyújthat az emberi patológiába.
epitheliális őssejtek alkalmazása regeneratív gyógyászatban
annak ellenére, hogy az ígéretes stratégiák emberi embrionális őssejteket és indukált pluripotens őssejteket (iPS) használnak a regeneratív gyógyászatban, e stratégiák kevés klinikai vizsgálata folyamatban van, ami részben a származás specifikációjának nehézségei és a tumorigenesis lehetősége miatt következik be. Mivel a felnőtt őssejtek alapvetően elkötelezettek bizonyos szövettípusok iránt, a tervezett sejttípusok előállítása viszonylag egyszerű, és a tumorigenesis potenciális kockázata alacsony. Így a terápiás megközelítések célja a felnőtt őssejtek felhasználása a transzplantáció sejtforrásaként. Bár Green és kollégái 1975-ben bevezették az emberi keratinocita tenyésztési módszert, és a tenyésztett sejtek átültethetők voltak égési vagy kémiai sérülésekkel küzdő betegekbe, más típusú felnőtt őssejtek hosszú távú tenyésztése jelentős technikai akadályoknak volt kitéve. Mint fentebb leírtuk, a legújabb technikai fejlődés legyőzte ezt a korlátozást a különféle hámsejtek esetében. Ezért az őssejtpopulációk gyors és hatékony bővítésének képessége értékes a regeneratív gyógyászatban való felhasználásuk szempontjából.
például az egér Lgr5+ vastagbél őssejtjeit kibővítették organoid tenyészetben, és átültetették a sérült egér vastagbélbe, és a beültetett sejteket, amelyek képesek voltak önmegújulni és differenciálódni, még 25 hét után is kimutatták . Egy másik megközelítésben Zhang K és kollégái mesterséges felnőtt őssejteket használtak fel egy transzplantációs vizsgálathoz. Először sikeresen tenyésztették a szaruhártya hámsejtjeit feeder sejtek nélküli edényben, majd megállapították, hogy a Pax6 kulcsfontosságú transzkripciós faktor, amely megkülönbözteti a szaruhártya őssejtjeit (CSCs) a bőr keratinocitáitól. Meglepő módon a keratinocitákban a pax6 túlzott expressziója limbális őssejtszerű sejteket indukált, és ezeket a sejteket át lehetett ültetni nyulak sérült szaruhártyájába . Mivel a keratinociták könnyebben hozzáférhetők, mint a CSC-k, ez a módszer alkalmazható az emberi szem betegségének kezelésére. Újabban, Liu et al. vonzó megközelítést jelentett a szövetek helyreállítására és regenerálására, amely endogén őssejteket használt. Vizsgálatukban a pax6-ot és Bmi1-et expresszáló lencse epitheliális őssejteket (lecs) jellemezték és regenerációs potenciált mutattak in vivo. Egy sebészeti szürkehályog eltávolítási módszert alkalmaztak, amely megőrzi az endogén Lec-ket, és ezek a LEC-k hozzájárultak a vizuális funkcióval rendelkező lencsék spontán regenerálódásához nyulakban, makákókban és emberi csecsemőkben. Ez a módszer terápiás áttörést jelenthet a szürkehályog kezelésében, és potenciálisan helyettesítheti a mesterséges intraokuláris lencse beültetését .
sok hámsejt magas forgalmi aránya miatt az őssejt-populációk átültetése elengedhetetlen a szövetek hosszú távú fenntartásához. Elméletileg egyetlen őssejt képes teljes szöveteket rekonstruálni, és több kutatócsoport empirikusan bizonyította ezt a fogalmat . A pluripotens őssejtek (PSC) potenciálja ellenére, amelyek minden sejttípust előidézhetnek, a PSC-ből származó szöveti őssejtek valószínűleg nem tarthatók fenn éretlen állapotban in vitro. Ezért a felnőtt őssejtek regeneratív gyógyászatban történő alkalmazása jelentős előnyt jelent.