onkológiai jelentések

Bevezetés

a tüdőrák rosszindulatú daganat, amelynek világszerte a legmagasabb a morbiditása és mortalitása, és előfordulása növekszik. A betegség körülbelül 80%-a tulajdoníthatónem kissejtes tüdőrák (NSCLC) (1). A korai diagnosztikai technikák korlátai és a korai specifikus klinikai megnyilvánulások hiánya miatt a betegek 70-80% – át előrehaladott stádiumban diagnosztizálják(2). Ezért kulcsfontosságú az ASAFE és a nem kissejtes tüdőcarcinoma hatékony gyógyszeres kezelésének azonosítása.

a legújabb eredmények azt mutatták,hogy az NSCLC előfordulását, fejlődését és átvitelét nemcsak genetikai tényezők befolyásolják,hanem az epigenetikai változás is fontos, beleértve a kis molekulájú, nem kódoló RNS-t (ncrns) (3). MikroRNS (miRNS), egy osztály endogénkis ncrns ~21-25 bázis hosszúsággal, széles körben létező ineukarióták, képes azonosítani egy specifikus célgén mRNS-jét(4). A miRNS-ek több mint 50% – át feltérképezik NSCLC-vel kapcsolatos törékeny helyek vagy genomi régiók, ami arra utal, hogy a miRNS expressziója szorosan összefügghet az NSCLC-vel. Amint arról beszámoltunk, a miRNS inNSCLC nagyszámú expressziója rendellenességet mutat, és a miRNS-ek egyensúlyhiánya elősegíti az NSCLC sejtciklusának előrehaladását, az anti-apoptotikus hatást, a nem kissejtes tüdőrák fokozott sejtinvázióját és metasztázisát(5).

a PI3K / Akt jelátviteli út fontosszerepet játszik a növekedési faktor által közvetített sejtek túlélésében. Korábbi megállapítások kimutatták, hogy a PI3K/Akt/mTOR útvonal rendellenessége fontos szerepet játszhat az NSCLC kialakulásában (6). Beszámoltak arról is, hogy a számos transzmembrán receptor és ligandum kombinációjával generált sejtproliferációs jel aktiválhatja a PI3K/Akt/mTOR jelátvitelét, amely szorosan összefügg az NSCLC proliferációjával és a túlélési státusszal (7). Ezek a receptorok közé tartozik a c-met, az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR), a c-kit és az inzulinszerű növekedési faktor receptor (IGF-IR).

a kurkumin a kurkuma kurkuma nemzetség növényének, a kurkuma és a kurkuma száraz rizómájából kivont természetes hatóanyag, kiterjedt farmakológiai hatásokkal, alacsony toxicitással és jó toleranciával, és gazdasági értéke miatt a feltárás hotspotjává vált (8). A kurkuminra összpontosító tanulmányok széles körű farmakológiai tevékenységeket azonosítottak, mint például gyulladásgátló, antioxidáns, lipid, vírusellenes, fertőzés elleni,rákellenes, antikoaguláns, májfibrózis és érelmeszesedés, alacsony toxicitás és kevés mellékhatás (9-13).Azonban a kurkumin hatása az NSCLC-re és az alapul szolgáló molekulamechanizmusra továbbra sem tisztázott. Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a kurkumin rákellenes hatását a humán NSCLC sejtproliferációjára és apoptózisára, és azonosítottunk egy lehetséges kapcsolatot e hatás és a miRNS-192-5p-Modulált PI3K/Aktsignaling útvonal között.

anyagok és módszerek

vegyi anyagok

a Dulbecco módosított Eagle táptalaját (DMEM) és fetalcalf szérumot (FBS) a Gibco-tól (Carlsbad, CA, USA) és(Dél-Amerika) vásárolták. A 3-(4,5-dimetil-tilt-tiazol-2-Il)-2,5 difenil-tetrazolium-bromidot (MTT) a Sangon Biotech-től(Sanghaj, Kína) vásárolták meg. Az apoptózis detektáló készletet vásároltamb Biosciences (San Jose, CA, USA). A kaszpáz – 3 aktivitási vizsgálatot a Promega-tól (Madison, WI, USA) vásárolták meg.

sejttenyészet

humán normál NCL-H460 és Beas-2e tüdő hámsejteket, valamint emberi a549 tüdőrákos sejteket nyertünk a második katonai Orvostudományi Egyetem CellResource központjából. Ezeket a sejteket DMEM-ben tenyésztettük, kiegészítve 10% FBS-sel (mindkettő a gibco-ból), 100 E/ml penicillinnel és 100 6G/ml sztreptomicinnel 37 / C-on, valamint egy 5% CO2-t tartalmazó humidifid inkubátorral. Megvizsgáltuk a kurkumin koncentrációját (5,10,20 és 40 MHz), valamint az időtartamot (12 és 24 óra) az A549 sejtekkel szemben. A kurkumin kémiai szerkezetét az ábra mutatja.1.

Sejtéletképesség-elemzés

a sejteket 5 db 103/kút sűrűséggel vetettük be 96 lyukú lemezekbe. Röviden, a sejtek életképességemérte az MTT assay (Sangon Biotech). Tíz mikroliter MTT-t (5 mg/l) adtunk mindegyik kútba, és 4 órán át inkubáltuk 37 6CC hőmérsékleten 5% CO2-t tartalmazó párásított inkubátorban. Dimetil-szulfoxid (150 6L; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) adunk minden jól, és keverjük 20 percig roomtemperature. Az abszorbanciát 450 nM-en mértük amicroplate olvasó segítségével.

Annexin V-FITC/propidium-jodid (PI)apoptózis analízis

a sejteket 1 6 6-os lyukú lemezeken 1db/kút sűrűséggel vetettük be. A tenyésztett sejteket kétszer megmossuk jéghideg PBS-sel, majd annexin V-FITC-vel megfestettük, és a gyártó utasításai (BD Biosciences) szerint az apoptózis detektáló készletet I-vel megfestettük. Az apoptózist flowcitometriával elemeztük CellQuest Pro (IVD) szoftver segítségével (mindkettő a BDBiosciences-től).

kaszpáz-3 aktivációs analízis

sejteket vetettünk be a sűrűség 5 Anavar 103/96-kút lemezek. A kaszpáz-3 aktivitást kaszpáz-3 aktivitási tesztkészlettel mértük a gyártó utasításai (Promega) szerint. Száz mikroliterreakciós puffert adtunk 10 6L szubsztrát Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroanilint (PNA) adtunk 10 6 ml proteincell lizátumhoz/kúthoz, és 37 6 h-on inkubáltuk. a kaszpáz-3 aktivitást 405 nm abszorbancián elemeztük.

Sejttranszfekció

a Mir-192-5p, az anti-miR-192-5p és a negatív kontrollmimikumokat (mir-NC) mind a Sangon Biotech-től vásárolták. A sejteket 6 lyukú lemezekbe vetették be, és 50-60% – os összefolyásig nőttek a transzfekció előtt. A mimikákat Lipofektamin2000-rel transzfektáltuk sejtekbe a gyártó utasításai szerint (Invitrogen Life Technologies). A gént vagy fehérjét 24 haftranszfekciót követően izoláltuk,és reverz transzkripciós-kvantitatívpolimeráz láncreakcióhoz (RT-qPCR) vagy western blot analízishez használtuk.

RT-qPCR

a sejteket 5 6db/kút sűrűséggel vetettük be 96dB lemezekbe. A teljes RNS-t kivontuka sejtekből TRIzol reagenssel (Invitrogen Life Technologies).A koncentrációs RNS-t nanodrop (nd-1000) spektrofotométerrel határoztuk meg (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA). A miRNS-ek számszerűsítését aegy TaqMan miRNA vizsgálati készlet (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA). A teljes RNS-t első szálú cDNS-szintézisnek vetettük alá ésprimescript RT reagenskészlet segítségével vizsgálták (mind Takara,Shiga, Japán). a qPCR-t SYBR-Green PCR Master Mix(Takara) alkalmazásával hajtottuk végre az ABI 7500ht rendszeren. A műveletekben használt alapozókat az I. táblázat mutatja.

I. táblázat az ott alkalmazott PCR primerek.

Western blot analízis

a sejteket 5 603/kút sűrűséggel vetettük be 96 lyukú lemezekbe. A tenyésztett sejteket kétszer mossuk jéghideg PBS-sel, majd jéghideg lízis pufferrel 30 percig inkubáljuk jégen. A sejtfolyadékot összegyűjtöttük és centrifugáltuk 12 000 g-on 10 percen át 4 6c-on. Az oldható fehérjekoncentráció volta BCA protein assay kit (Sigma, St. Louis, MO,USA) segítségével határozták meg. Az összes fehérjét (10 6G) 12%-os nátrium-dodecil-szulfát (SDS) – poliakrilamid géleken futtattuk, és polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra vittük át. A membránokat trisz-pufferelt sóoldattal (TBS) blokkoltuk, amely 5% zsírmentes tejet tartalmazott a nem specifikus kötő helyek blokkolására. A membránokat anti-PI3K-val (1:1500) és anti-Akt-val (1:1000) inkubáltuk (mindkettő a Santa CruzBiotechnology, Inc. – től származik., Santa Cruz, CA, USA) és anti-ons-aktin (1:500;Sangon Biotech) egy éjszakán át, C. 4-kor. 1% Tween-20/PBS-sel történő mosás után a membránokat a másodlagos antitestekkel (Tiangen, Peking, Kína) inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten.A fehérjéket fokozott kemilumineszcenciával detektáltuk (Vilber, Marne La Vallon Aptonce, Franciaország).

statisztikai elemzés

a statisztikai elemzéseket SPSS 19.0 szoftverrel végeztük. Az eredményeket átlagként mutatjuk be. Az eredményeket a hallgató t-tesztjével vagy egyirányú varianciaanalízissel(ANOVA) elemezték. A p<0, 05 statisztikailag szignifikánsnak tekinthető.

eredmények

a kurkumin gátolja az a549 sejtek életképességét

a kurkuminnak az A549 sejtekkel szembeni koncentrációját (5, 10, 20 és 40 km) és az időperiódusokat (12, 24 vagy 36 óra) MTT-vizsgálattal vizsgálták. Fig.A 2. ábra azt mutatja, hogy az A549 sejtek 12, 24 vagy 48 h – val történő kezelése 10, 20 és 40 MHz-es kurkuminnal gátolta a sejtek életképességét adóz-és időfüggő módon. Az MTT vizsgálat azt mutatta, hogy a kurkumin (20 és 40 db) kezelés 24 vagy 36 órán át jelentéktelen sejt életképességet eredményezett a kontroll csoporthoz képest(ábra. 2).

a kurkumin az A549 sejtek apoptózisát indukálja

a kezelés előtt a kurkuminnal kezelt (10, 20 vagy 40 db) a549 sejtek apoptotikus arányát is mérték. Kezelést követően 20 vagy 40 6db kurkumin for24 h, az apoptotikus arány jelentősen nőtt a dózis-dependentmanner, összehasonlítva a kontroll csoport(ábra. 3).

a kurkumin indukálja az a549 sejtek kaszpáz-3 aktivitását

annak meghatározásához, hogy a kurkumin indukálja-e az A549 sejtek kaszpáz-3 aktivitását, a kaszpáz-3 aktivitást acaspase-3 aktivitási assay kit segítségével mértük. A kaszpáz-3 aktivitás szintén növekedettjelentősen dózisfüggő módon a kurkumin (20 vagy 40 db) 24 órás kezelés után, a kontroll csoporthoz képest (ábra. 4). Ezek az eredmények jeleztékhogy a kurkumin apoptózist indukált az A549 sejtekben.

a miR-192-5p gátolja a sejtek életképességét és indukálja az a549 sejtek apoptózisát

a mir-192-5p expressziójának és jelentőségének vizsgálatához az emberi normál tüdőhámsejtekben és a tüdőrákos sejtekben a MIR-192-5p relatív expressziót RT-qPCR alkalmazásával detektáltuk.Fig. Az 5A azt mutatja, hogy az NCL-H460 sejtek mir-192-5prelatív expressziója viszonylag alacsonyabb volt, az ofA549 sejteké magasabb volt, a Beas-2e sejtek voltak a legerősebben kifejezve.

annak elemzéséhez, hogy a miR-192-5p befolyásolta-e az a549 sejtek sejtélhetőségét és apoptózisát, mir-192-5pmimikákat transzfektáltunk A549 sejtekbe. A Mir-192-5pmimics-szel transzfektált sejtek szignifikáns, 120-szoros növekedést mutattak a miR-192-5p expresszióban 48 óra transzfekció után, összehasonlítva a kontroll ormiR-NC csoporttal (ábra. 5B).A Mir-192-5P túlzott expressziója csökkentette az a549 sejtek életképességét,összehasonlítva a kontroll vagy a Mir-NC csoporttal (ábra. 5C). A mir-192-5p túlzott expressziója azonban az a549 sejtek apoptotikus sebességét indukálta, összehasonlítva a kontroll vagy a Mir-NC csoporttal (ábra.5D).

a Mir-192-5p gátlása elnyomja a sejtélhetőséget és indukálja az a549 sejtek apoptózisát

annak megállapításához, hogy az anti-miR-192-5p befolyásolta-e az A549 sejtek sejt életképességét és apoptózisát, transzfektáltuk az anti-miR-192-5p mimikákat az A549 sejtekbe. A mir-192-5p expressziós szintjét RT-qPCR alkalmazásával detektáltuk 48 óra transzfekció után.Anti-mir-192-5P utánozza hatékonyan elnyomta a miR-192-5prelatív expressziója a549 sejtek (ábra.6A). A Mir-192-5p downregulációja elősegítette a sejtek életképességét és gátolta az a549 sejtek apoptotikus sebességét, összehasonlítva a kontroll vagy a Mir-NC csoporttal (ábra.6B és C).

kurkumin gátolja mir-192-5P geneexpression a549 sejtek

annak meghatározására, hogy a kurkumin befolyásolta mir-192-5pgén expresszióját a549 sejtek, az expressziós szintje mir-192-5P detektáltuk RT-qPCR kezelést követően kurkumin 24h. ábra. A 7. ábra azt mutatja, hogy a Mir-192-5p expressziós szintjét jelentősen javította a kurkumin (20 vagy 40 MHz).

a miR-192-5p gátolja a kurkumin hatását a sejtek életképességére, és az a549 sejtek apoptózisát indukálja

annak vizsgálatára, hogy a Mir-192-5P túlzott expressziója hogyan befolyásolta a kurkumin hatását a sejtek életképességére és az a549 sejtek apoptotikus sebességére, a Mir-192-5P-t transzfektáltuk az aa549 sejtekbe. Fig. A 8. ábra azt mutatja, hogy a kurkumin elnyomta a sejtek életképességét, és növelte az a549 sejtek apoptotikus arányát a kurkuminnal végzett kezelést követően (20 6db) 24 órán keresztül, a kontroll csoporthoz képest. A kurkuminnal kezelt csoporthoz képest a kurkumin (20 ft) hatása a sejtek életképességére és az a549 sejtek apoptotikus arányára jelentősen csökkent és nőtt a Mir-192-5pmimikákkal. 8A).

a Mir-192-5p gátlása elnyomja a kurkumin hatását a sejtek életképességére, és az a549 sejtek apoptózisát indukálja

annak vizsgálatára, hogy a Mir-192-5P downregulációja hogyan befolyásolta a kurkumin hatását a sejtek életképességére és az a549 sejtek apoptotikus sebességére, transzfektáltuk az anti-miR-192-5p mimicsinto a549 sejtek. Fig. A 9. ábra azt mutatja, hogy a kurkumin elnyomta a sejtek életképességét, és növelte az a549 sejtek apoptotikus arányát a kurkuminnal végzett kezelést követően (20 6-24 óra), a kontroll csoporthoz képest. Ugyanakkor a kurkumin (20 6 mm) hatása a sejtek életképességére és az a549 sejtek apoptotikus arányára jelentősen megnőtt és csökkent az anti-miR-192-5p mimikákkal összehasonlítva a kurkuminnal kezelt csoporttal (ábra.9A).

a kurkumin gátolja az A549 sejtek PI3K/Akt proteinexpresszióját

annak megállapítására, hogy a kurkumin befolyásolta-e az A549 sejtek PI3K/Aktprotein expresszióját, a PI3K/Akt fehérje expressziót western blot analízissel detektálták a kurkumin 24 órás kezelését követően. A 10.ábra azt mutatja, hogy a PI3K/Akt fehérje expresszióját jelentősen javította a kurkumin (20 vagy 40 ft).

a miR-192-5p közvetlenül a PI3K/Akt ofA549 sejteket célozza meg

annak vizsgálatára, hogy a miR-192-5p túlzott expressziója hogyan befolyásolta az A549 sejtek PI3K/Akt fehérje expresszióját, a Mir-192-5p a549 sejtekké imitálódik. Fig. A 11A és a B azt mutatja, hogy a kurkumin elnyomta az A549 sejtek PI3K/Akt fehérje expresszióját a kurkuminnal végzett kezelést követően (20 6cm) 24 órán keresztül, összehasonlítva a kontrollcsoporttal. A kurkumin hatása (20 Ft) Az a549 sejtek PI3K/Akt fehérje expressziójára nyilvánvalóan csökkent a Mimir-192-5p mimikákkal összehasonlítva a kurkuminnal kezelt csoporttal(ábra. 11C és D).

a Mir-192-5p gátlása növeli az a549 sejtek PI3K/Akt expresszióját

annak meghatározása érdekében, hogy az anti-mir-192-5p befolyásolta-e a kurkumin hatását az A549 sejtek PI3K/Akt fehérje expressziójára, a fertőzött anti-miR-192-5p utánozza az A549 sejteket. Fig. A 12a és a B azt mutatja, hogy a kurkumin elnyomta az A549 sejtek PI3K/Akt fehérje expresszióját a kurkuminnal történő kezelést követően (20 6cm) 24 órán keresztül, a kontroll csoporthoz képest. Azonban a kurkumin (20 db) hatását az A549 sejtek PI3K/Akt fehérje expressziójára jelentősen fokozta az anti-miR-192-5p mimika, összehasonlítva a kurkuminnal kezelt csoporttal (ábra.12C és D).

megbeszélés

évente egymillió beteg szenved NSCLC-ben világszerte, és az NSCLC előfordulása fokozatosan növekszik.Bár az elmúlt években számos tanulmány az NSCLC-re összpontosított,a kezelés tekintetében nem történt nagy előrelépés. A műtét továbbra is a leghatékonyabb kezelési módszer, de a megelőzés, valamint az NSCLC patogenezisének szempontjából további vizsgálatokat kell végezni (14,15). Nemrégiben Liu et al azonosította, hogy a kurkumin gátolja a proliferációt és jelentősen indukálja a gyomorrákos sejtek apoptotikus sebességét (16). Ma és mtsai kimutatták, hogy a kurkumin gátolja a sejtek növekedését és a hasnyálmirigyrák inváziójátsejtek (17). Az ourfindings együttesen azt mutatta, hogy a kurkumin elnyomta a sejtek életképességét, indukálta a sejtek apoptózisát és növelte az A549 sejtek kaszpáz-3 aktivitását.Ezért a kurkumin potenciális gyógyszer az onkoterápiában.

a miRNS a kis molekulájú RNS egyik osztálya, amelynek a közelmúltban azonosított rendkívül fontos szerepe van a génexpresszió szabályozásában (18). a miRNS gének vannakáltalában a gén intron szegmenseiben található. A miRNS-ek azonban a gén és az intergén régió nem kódoló exonjain kívül is eloszlanak, amelyekről kiderült, hogy részt vesznek az ismert onc ogenikus utak változatosságában, mint például a p53, a Bcl-2 és a K-Ras(19). Kimutatták, hogy a meghatározott emberi miRNS-ek>50% – a a genom törékeny területein található, és ezek a törékeny helyek gyakran társulnak a nem kissejtes tüdőcarcinoma előfordulásával (20). A miRNS-ek expressziós profiljai az NSCLC fejlesztéséhez kapcsolódnak. a MIR-34c, a miR-145 és a miR-142 gátolhatja az NSCLC-t (5). A jelen tanulmány eredményei azt mutatják, hogy az NCL-H460 sejtek mir-192-5p relatív expressziója viszonylag alacsony volt, az A549 sejteké magasabb volt, a Beas-2e sejtek voltak a leginkább kifejezettek. A miR-192-5p túlzott expressziója csökkentette a sejtek életképességét és növelte az a549 sejtek apoptotikus sebességét. A miR-192-5p downregulációja növelte a sejtek életképességét és csökkentette az a549 sejtek apoptotikus sebességét.Ezenkívül a kurkumin gátolta a Mir-192-5p gén expresszióját A549cellák. A Mir-192-5P expresszió upregulációja azonban fokozta a kurkumin hatását a sejtek életképességére és az a549 sejtek apoptotikus sebességére, míg a Mir-192-5p expresszió downregulációja megfordította a kurkumin a549 sejtekre gyakorolt hatását. Eredményeink összhangban voltak más tanulmányok eredményeivel. Például Ye etal arról számolt be, hogy a kurkumin elősegíti a sejtek apoptózisát a mir-192-5p aktiválásával (21). Azonban a kurkumin mir-192-5pexpresszióra gyakorolt hatásának lehetséges mechanizmusai nem egyértelműek, és a jövőbeni vizsgálatokat ennek a hatásnak a meghatározására kell elvégezni.

az elmúlt években a PI3K/Aktsignaling útvonal hatása az emberi NSCLC-re nagy figyelmet kapott(22). A PI3K/Aktsignaling útvonal aktiválása nagyon gyakori az emberi NSCLC-ben, amely elősegítheti a rák előfordulását különféle mechanizmusok révén, beleértve a génmutációkat, a Rákszuppresszor gén Ptenexpressziójának csökkentését, PI3K mutációt vagy amplifikációt, Akt mutációt vagy amplifikációt és onkogén receptor aktiválást (7). Ennek az útnak az egyes komponenseinek aktiválása a fő oka a nem kissejtes tüdőcarcinoma kedvezőtlen prognózisának,amely a kezelés gyógyszerrezisztenciájához vezethet, így ennek az útnak a gátlása megfordíthatja a gyógyszerrezisztenciát és javíthatja a kemoterápiát és a sugárzási hatásokat in vivo (23). A jelen tanulmányban kapott adatok azt mutatták, hogy a kurkumin elnyomta az A549 sejtek PI3K/Akt proteinexpresszióját. A MIR-192-5p expresszió upregulációja megakadályozta az A549 sejtek PI3K/Akt fehérje expresszióját.A MIR-192-5p expresszió csökkentése növelheti az A549 sejtek PI3K/Aktprotein expresszióját. Xu és mtsai kimutatták, hogy a kurkumin gátolja az ftc133 sejtvia invázióját és migrációját a PI3K/Akt jelátviteli út lefelé szabályozásában a pajzsmirigyrákos sejtekben (24). Xu et azt is javasolta, hogy a kurkumin gátolja a tüdőrák tumor proliferációját a PI3K / Akt útvonalon keresztül (25).Schee és munkatársai kimutatták, hogy a Mir-22-3p, a miR-143-3p és a mir-192-5p szabályozták és részt vettek az APC-ben, a TGF-ben és a Pi3kpathway-ben a colorectalis rákos sejtekben (26).

összefoglalva, ez a tanulmány a kurkumin a549 sejtekkel szembeni hatására összpontosított, gátolta a sejtproliferációt és indukálta az emberi NSCLC apoptózisát a mir-192-5p szabályozásán és a PI3K/Akt jelátviteli út elnyomásán keresztül. A jelen tanulmány következtetései azt mutatják, hogy a kurkumin aPotenciális célpont az NSCLC kezelésében. A jelen vizsgálat azonban bizonyos korlátokat tárt fel, mivel nem vizsgáltuk a Mir-192-5p és a tüdőrákos sejtekben a PI3K/Akt útvonal közötti részletes összefüggést. Az eredmények igazolására további in vivo, klinikai ésnagyobb léptékű statisztikai elemzéseket kell végezni a jelen vizsgálatról.