splicing Alternativo
Spliceosomes
Splicing fuori introni
Altri eventi di splicing
tecnologia del DNA Ricombinante
Applicazioni di gene splicing
Risorse
Geni sono sequenze di DNA che codificano per proteine. Lo splicing genico è una forma di ingegneria genetica in cui specifici geni o sequenze geniche vengono inseriti nel genoma di un organismo diverso. Lo splicing genico può anche riferirsi specificamente a una fase durante la lavorazione dell’acido desossiribonucleico (DNA) per prepararlo a essere tradotto in proteine.
Lo splicing genico può anche essere applicato a tecniche di biologia molecolare che mirano a integrare varie sequenze di DNA o gene nel DNA delle cellule. I singoli geni codificano proteine specifiche e, in base ai risultati del progetto Genoma umano, si stima che ci siano circa 30.000 geni in ogni cellula del corpo umano. Poiché le funzioni cellulari nei diversi tessuti hanno scopi diversi, i geni subiscono uno sforzo concertato complesso per mantenere il livello appropriato di espressione genica in modo specifico del tessuto. Ad esempio, le cellule muscolari richiedono proteine specifiche per funzionare e queste proteine differiscono notevolmente dalle proteine nelle cellule cerebrali. Sebbene l’informazione genetica sia, per la maggior parte, la stessa in entrambi i tipi di cellule, i diversi scopi funzionali determinano diverse esigenze cellulari e quindi diverse proteine sono prodotte in diversi tipi di tessuto.
I geni non sono espressi senza i segnali appropriati. Molti geni possono rimanere inattivi. Con la stimolazione appropriata dell’espressione genica, la cellula può produrre varie proteine. Il DNA deve prima essere trasformato in una forma che altre molecole nella cellula possono riconoscere e tradurlo nella proteina appropriata. Prima che il DNA possa essere convertito in proteine, deve essere trascritto in acido ribonucleico (RNA). Ci sono tre fasi nella maturazione dell’RNA; splicing, tappatura e poliadenilazione. Ognuno di questi passaggi è coinvolto nella preparazione dell’RNA appena creato, chiamato trascrizione dell’RNA, in modo che possa uscire dal nucleo senza essere degradato. In termini di espressione genica, lo splicing dell’RNA è il punto in cui lo splicing del gene accade in questo contesto alle posizioni specifiche in tutto il gene. Le aree del gene che sono impiombate sono rappresentano regioni non codificanti che intervengono sequenze note anche come introni. Il DNA che rimane nell’RNA processato viene indicato come regioni codificanti e ciascuna regione codificante del gene è nota come esoni. Pertanto, gli introni intervengono sequenze tra esoni e lo splicing genico comporta l’escissione di introni e l’unione di esoni. Quindi, la sequenza finale sarà più breve del gene codificante originale o della sequenza di DNA.
Per apprezzare il ruolo dello splicing nel modo in cui i geni sono espressi, è importante capire come un gene cambia nella sua forma funzionale. Inizialmente, l’RNA è chiamato RNA precursore (o pre-RNA). I pre-RNA vengono quindi ulteriormente modificati in altri RNA chiamati RNA di trasferimento (tRNA), RNA ribosomiale (rRNA) o RNA messaggero (mRNA). Gli MRNA codificano le proteine in un processo chiamato traduzione, mentre gli altri RNA sono importanti per aiutare l’mRNA a essere tradotto in proteine. L’impionbatura del RNA crea le molecole funzionali del RNA dai pre-RNA.
Lo splicing di solito procede in modo predeterminato per ciascun gene. Gli esperimenti che hanno fermato la formazione della trascrizione a diversi intervalli di tempo mostrano che lo splicing seguirà un percorso principale che inizia con un introne e procede selettivamente ad un altro, non necessariamente adiacente, introne. Anche se altri percorsi possono essere seguiti, ogni trascrizione ha una propria sequenza primaria per l’escissione intronica.
Splicing alternativo
Un singolo gene può essere elaborato per creare numerosi prodotti genici o proteine e questo processo è indicato come splicing alternativo. In questo caso, una diversa combinazione di esoni rimane nell’RNA elaborato. Lo splicing alternativo del gene in vari siti di intron-esone all’interno di un gene può essere utilizzato per creare diverse proteine dalla stessa molecola di pre-RNA. Le proteine sono costituite da più domini. Esoni diversi possono codificare per domini diversi. L’impionbatura selettiva può rimuovere gli esoni indesiderati come pure gli introni. Le combinazioni di proteine che possono essere prodotte dallo splicing alternativo sono correlate nella struttura o nella funzione ma non sono identiche. Utilizzando un singolo gene per creare più proteine, il DNA delle cellule può essere utilizzato in modo più efficiente.
Lo splicing alternativo può essere specifico del tessuto in modo tale che diverse proteine siano prodotte dallo stesso gene originale da due o più tipi di cellule diverse. O un tipo di cellula può fare configurazioni multiple usando lo stesso gene. Ad esempio, un tipo di cellula immunitaria chiamata cellula B produce anticorpi contro numerosi antigeni. Gli antigeni sono sostanze estranee, che innescano le risposte immunitarie e gli anticorpi si legano e gli antigeni in modo che possano essere scomposti e rimossi. Sebbene sia possibile produrre un numero infinito di anticorpi, tutti gli anticorpi rientrano in uno dei cinque sottotipi di base. Lo splicing alternativo viene utilizzato per creare questi cinque tipi di anticorpi dallo stesso gene.
Gli anticorpi sono costituiti da molecole multiple di immunoglo-bulina (Ig). Queste molecole a loro volta hanno più domini. Un particolare dominio chiamato regione costante della catena pesante distingue i cinque sottotipi di anticorpi, chiamati IgM, IgD, IgG, IgE e IgA. I diversi tipi di anticorpi servono varie funzioni nel corpo e agiscono in tessuti corporei distinti. Ad esempio, le IGA vengono secrete nella mucosa gastrointestinale e legG passano attraverso la placenta. Il gene che codifica queste regioni a catena pesante contiene esoni che dirigono la produzione di singoli sottotipi, e il gene è alternativamente impiombato per produrre una trascrizione mRNA finale, che può fare uno qualsiasi di essi.
La maggior parte dei geni produce solo una trascrizione; tuttavia, i geni che producono più trascritti hanno numerosi ruoli cellulari e di sviluppo. Splicing alternativo controlla la determinazione del sesso nelle mosche Drosophila melanogaster. E un certo numero di proteine sono espresse in modo differenziato dallo stesso gene in varie cellule. Diverse cellule muscolari utilizzano splicing alternativo per creare proteine di miosina specifiche delle cellule. E le cellule embrionali in vari stadi di sviluppo producono molteplici forme della proteina, l’acido retinoico. Alcune trascrizioni differiscono dalle trascrizioni correlate nell’estremità 5′ e altre possono variare all’estremità 3′.
Spliceosomi
Le molecole o complessi molecolari che effettivamente splicano RNA nel nucleo cellulare sono chiamati spliceosomi. Gli spliceosomi sono costituiti da piccole sequenze di RNA legate da piccole proteine aggiuntive. Questo complesso dello spliceosoma riconosce le sequenze particolari del nucleotide al confine dell’introne-esone. DNA e RNA sono entrambi generalmente letti nella direzione 5 ‘a 3′. Questa designazione è fatta sulla base dei legami fosfo-diestere, che costituiscono la spina dorsale dei filamenti di DNA e RNA. Gli introni vengono prima tagliati alla loro estremità 5′ e poi alla loro estremità 3’. I due esoni adiacenti vengono quindi legati insieme senza l’introne. Lo spliceosoma è un complesso enzimatico che esegue ciascuno di questi passaggi lungo il pre-RNA per rimuovere gli introni.
I piccoli RNA che compongono lo spliceosoma non sono MRNA, RRNA o TRNA; sono piccoli RNA nucleari (snRNA). Gli SNRNA sono presenti in concentrazioni molto basse nel nucleo. Gli SNRNA si combinano con le proteine per comprendere, piccole particelle nucleari di ribo-nuclearprotein. Diversi snRNPs si aggregano per formare uno spliceosome. Questa struttura secondaria riconosce diverse regioni chiave nell’introne e al confine introne-esone. In sostanza, snRNPs svolgono un ruolo di splicing catalitico. L’assenza di singoli componenti snRNP può inibire lo splicing. snRNPs sono solo uno dei molti complessi che possono regolare l’espressione genica.
Oltre agli snRNPs, alcuni introni hanno funzionalità di splicing automatico (self). Questi introni sono chiamati introni di gruppo II. Gli introni del gruppo II si trovano in alcuni geni mitocondriali, che provengono da un genoma separato dal nucleo e si trova in piccoli compartimenti all’interno della cellula chiamata mitocondri. Mitochrondria funziona per fornire energia per il fabbisogno energetico delle cellule. Sebbene tutto il DNA cromosomico si trovi nel nucleo, alcuni geni si trovano nei mitocondri delle cellule. Gli introni del gruppo II formano strutture secondarie usando la loro regione interna di introni in modo simile agli introni nucleari. Tuttavia, questi introni mitocondriali dirigono l’esone-esone ricongiungendosi da soli senza snRNPs.
Splicing fuori introni
Varie sequenze di segnale di splicing sono universali e si trovano all’interno di ogni sito introne impiombato, mentre alcune sequenze di segnale sono unici per i singoli geni. Il DNA è costituito da basi chiamate nucleotidi, che rappresentano l’alfabeto del DNA. Ci sono quattro basi, Adenina (A), guanina (G), timina (T) e citosina (C). La maggior parte degli introni nelle forme di vita superiori inizia con la sequenza nucleotidica G-T e termina con la sequenza A-G. Le sequenze definiscono i bordi “sinistro” (5′) e “destro” (3′) dell’introne e sono descritte come conformi alla regola GT-AG. Mutazioni in una qualsiasi di queste quattro posizioni producono introni che non possono essere rimossi dai normali meccanismi di splicing. All’interno dell’introne c’è un’altra sequenza altamente conservata che ha una certa variabilità nei geni di una specie; questa regione (chiamata sito del ramo) è l’area che si collega all’estremità 5′ dell’introne mentre viene tagliata e poi si arriccia per formare una forma lariata. Questo lariat è un ciclo nell’introne che è formato mentre è rimosso dall’RNA di maturazione.
Altri eventi di splicing
Lo splicing può anche coinvolgere molecole diverse dall’mRNA. I TRNA, che svolgono un ruolo cruciale nell’allineamento degli amminoacidi lungo una proteina sintetizzata, possono essere sottoposti a splicing. I TRNA sono codificati dal DNA solo
TERMINI CHIAVE
Anticorpo-Una molecola creata dal sistema immunitario in risposta alla presenza di un antigene (una sostanza estranea o particella). Segna microrganismi estranei nel corpo per la distruzione da parte di altre cellule immunitarie.
Antigene-Una molecola, di solito una proteina, che il corpo identifica come estraneo e verso il quale dirige una risposta immunitaria.
Capping-Una modifica alla fine di 5′ di una trascrizione mRNA matura.
Citoplasma-Tutto il protoplasma in una cellula vivente che si trova al di fuori del nucleo, come distinto dal nucleoplasma, che è il protoplasma nel nucleo.
Acido desossiribonucleico (DNA) – Il materiale genetico in una cellula.
Esoni-Le regioni del DNA che codificano per una proteina o formano tRNA o mRNA.
Gene-Un’unità discreta di eredità, rappresentata da una porzione di DNA situata su un cromosoma. Il gene è un codice per la produzione di un tipo specifico di proteina o molecola di RNA, e quindi per una specifica caratteristica ereditaria.
Genoma-L’insieme completo di geni che un organismo porta.
Introni-Sequenze non codificanti in un gene che vengono giuntate durante l’elaborazione dell’RNA.
Mitocondri-organello intracellulare che è separato dal nucleo, ha il proprio genoma ed è importante per la produzione di energia per vari tessuti.
Poliadenilazione-Una modifica alla fine 3′ di una trascrizione mRNA matura.
DNA ricombinante —DNA che viene tagliato utilizzando enzimi specifici in modo da poter inserire un gene o una sequenza di DNA.
Splicesome-Il macchinario intracellulare che elabora l’RNA rimuovendo gli introni dalla sequenza.
come tutte le altre molecole di RNA. Tuttavia, i TRNA hanno una struttura e una funzione uniche distinte da altre molecole di RNA in quanto sono responsabili della corrispondenza dei blocchi di costruzione della proteina reale (amminoacidi) dalla sequenza nucleotidica codificata per costruire una proteina o polipeptide. Poiché questi RNA specializzati hanno conformazioni uniche, gli enzimi che si uniscono agli esoni dopo la rimozione dell’introne differiscono da quelli che si uniscono agli introni in altre molecole di RNA. Mentre gli introni vengono rimossi e gli esoni vengono uniti, le molecole enzimatiche non sono le stesse utilizzate per l’elaborazione dell’mRNA. La rimozione dell’introne nell’elaborazione del tRNA dipende meno dalle sequenze interne dell’introne rispetto ad altri introni dell’RNA.
Tecnologia del DNA ricombinante
I progressi nella comprensione dei meccanismi che descrivono come avviene lo splicing genico hanno portato alla capacità degli scienziati di tagliare e ricottura di sequenze nucleotidiche, chiamate anche tecnologia del DNA ricombinante. Poiché splice significa letteralmente l’unione di estremità separate, splicing genico si riferisce all’unione di quasi tutte le sequenze nucleotidiche per creare un nuovo prodotto genico o per introdurre una nuova sequenza genica. Quindi, quasi ogni sequenza genetica potrebbe essere impiombato in un’altra sequenza.
Alcuni enzimi chiamati enzimi di restrizione sono utilizzati nei laboratori per unire, collegare (o legare) e rimuovere o aggiungere nucleotidi alle sequenze. Gli enzimi di restrizione sono utilizzati nella tecnologia del DNA ricombinante per rimuovere e inserire sequenze genetiche da e in altre sequenze. Questa tecnologia ha permesso ad alcune aziende biotecnologiche e farmaceutiche di produrre grandi quantità di proteine essenziali per scopi medici e di ricerca. Ad esempio, una proteina di insulina umana può essere prodotta in grande quantità inserendo il gene dell’insulina nel genoma dei batteri, ad esempio, al fine di produrre grandi quantità di proteine. Come una fotocopiatrice, tali sequenze possono produrre molta insulina per i diabetici che non sono in grado di produrre abbastanza insulina da soli. Questi pazienti possono quindi auto-iniettare l’insulina purificata per trattare la loro malattia.
Applicazioni di splicing genico
Utilizzando la tecnologia di splicing genico, sono stati prodotti vaccini. DNA da un virus può essere impiombato nel genoma di un ceppo innocuo di ceppo batterico. Quando i batteri hanno prodotto la proteina virale, questa proteina può essere raccolta. Poiché i batteri crescono rapidamente e facilmente, una grande quantità di questa proteina può essere estratta, purificata e utilizzata come vaccino. Viene introdotto in un individuo per iniezione, che susciterà una risposta immunitaria. Quando una persona è infettata da un virus per esposizione naturale, una rapida risposta immunitaria può essere avviata a causa dell’inoculazione iniziale. Un’altra applicazione della tecnologia di speziatura genica è legata al gene coinvolto nella produzione di vitamina B. Questo gene è stato rimosso da un genoma di carote e impiombato nel genoma del riso. Il ceppo di riso ricombinante geneticamente modificato viene quindi modificato per produrre vitamina B. Questo può avere molti benefici per la salute, in particolare nei paesi del terzo mondo che si affidano al riso come fonte di cibo principale e non hanno accesso a fonti alimentari ricche di vitamine.
Gene splicing tecnologia, quindi, permette ai ricercatori di inserire nuovi geni nel materiale genetico esistente di un genoma organismi in modo che interi tratti, dalla resistenza alle malattie alle vitamine, e può essere copiato da un organismo e trasferito un altro.
Risorse
LIBRI
Sala, Stephen e James Watson. Frontiere invisibili: la corsa alla sintesi di un gene umano. Oxford: Oxford University Press, 2002.
Keller, Evelyn Fox. Il secolo del Gene. Boston: Harvard University Press, 2002.
Lambrecht, Bill. Cena al New Gene Cafe: come l’ingegneria genetica sta cambiando ciò che mangiamo, come viviamo e la politica globale del cibo. New York: St. Martin’s Press, 2002.
Louise Dickerson