ヒキガエルの三つの亜種における酸素に対するヘモグロビン親和性（Bufo sp.
HRVOJ OSTOJIC1,CARLOS MONGE-C2,VERONICA CIFUENTES3
1Clinicum Laboratorio Automatizado,Iquique,Chile
2Laboratorio de Transporte de Oxígeno,Universidad Peruana Cayetano Heredia,Lima,Perú
3Universidad Arturo Prat,Iquique,Chile
概要
血液酸素親和性と赤血球特性は、海面および20℃の平均日の温度で収集されたbufo属の三つの亜種：bufo spinulosus limensisで測定されました; Bufo spinulosus trifolium、3100mから、15º Cの平均日の温度;およびBufo spinulosus flavolineatus、4100mから、10º cの平均日の温度。 ヘモグロビンの電気泳動は三つの亜種のそれぞれで同じ成分を示した。 20℃で血液酸素親和性（P50）は、Bufo spinulosus limensisとBufo spinulosus trifoliumの間に小さな違いを示したが、Bufo spinulosus flavolineatusの値は著しく低かった。 10º c、Bufo spinulosus flavolineatusの周囲温度では、P50は、対応する周囲温度で他の二つの亜種と比較して非常に低かった。
キーワード：適応、高度、両生類、Bufo spinulosus limensis、Bufo spinulosus trifolium、Bufo spinulosus flavolineatus、ヘモグロビン親和性、ヘマトクリット、酸素結合、ヒキガエル
はじめに
ペルーでは、Bufo属は海抜4000m以上の高度勾配を占めています。 種Bufo spinulosusは、ニッチが低、中、高高度にある3つの亜種を持っています。 これらの亜種は、Bufo spinulosus limensis（低高度）、Bufo spinulosus trifolium（中間高度）およびBufo spinulosus flavolineatus（高高度）（12）である。 脊椎動物における呼吸器系の最も集中的に研究された環境適応の一つは、胚発生（例えば、子宮内）と水生、特に淡水、環境において、高高度で様々に発生する低酸素症のことである。 これらの適応は、一般的に、赤血球の特性、酸素運搬能力、またはヘモグロビンの酸素親和性の変化を含む。 異なる条件下で同じ動物に起こる種内適応は、一般的にアロステリック因子（すなわち、赤血球内でヘモグロビンが機能する条件）の変化を伴うが、異なる種を比較するときに明らかな種間適応は、ヘモグロビン分子の特性の変化に起因する。
赤血球およびヘモグロビン特性における低酸素適応に関するほとんどの研究は魚類および哺乳動物を対象としており、低異熱性脊椎動物 以前の研究では、チチカカ湖のカエルTelmatobius culeus(2)3800mに住んでいることが示されました。 本研究では，Ｂｕｆｏ亜種における適応について述べた。
材料と方法
亜種Bufo spinulosus limensisのアヌランは、リマの私たちの研究室から約400km（海面、平均日気温20℃）の海岸平野から採取されました。 Bufo spinulosus trifoliumはペルー中央アンデス（約3100m、平均日の温度15º C）で収集され、Bufo spinulosus flavolineatusも中央アンデス（4100m、平均日の温度10º C）で収集された。 動物は数時間以内に私たちの研究室に持ち込まれました。 血液は、以前に髄動物の心臓からヘパリン化注射器に描かれました。 約3mlの血液はBufo spinulosus limensisから得られ、1-1.5mlは他の亜種から得ることができた。 決定を行うために、二から三匹の動物からの血液をプールした。 赤血球数，ヘモグロビン濃度およびヘマトクリットを従来の方法で測定した。
ヘモグロビンの電気泳動は、ヘモグロビン電気泳動に特異的な緩衝液中の酢酸セルロースストリップ上で実行され、バンドはPonceau Sで染色され、Helena Laboratories（USA）の取扱説明書に従った濃度計で読み取られた。 ＜2189＞＜1815＞血液-酸素親和性（P50）は、混合技術（1,10）によって10℃、15℃および20℃で測定した。 血液平衡は、4.5％のCO2および可変O2およびN2濃度を含むガス混合物を使用して、これらの温度に維持眼圧計で行われた。 血液O2飽和度は30と80％の間で変化した。 Ｐ ｈ計は高精度のりん酸緩衝液を用いて校正した。
平衡温度（eq）でのpH値は、ローゼンタール（8）によって与えられる式を用いて測定温度（meas）でのpH値から計算された：
pHeq=pH meas+0.0147（Teq_Tmeas）
ボーア因子は、血液pHを以下のように変 血液アリコートから調製した血しょうを乳酸で酸性化するか，水酸化ナトリウムでアルカリ化し，対応する赤血球で再構成した。 Bufo spinulosus limensisとBufo spinulosus trifoliumからの血液サンプルは、20º Cと15º Cで平衡化され、Bufo spinulosus flavolineatusからの血液は20º Cと10º Cで、各温度（14）のボーア因子を計算するために異なるpH値で平衡化された。 この因子は三つの温度での標準血液ｐ ｈの計算を可能にした。 ヒル係数（ｎ）を計算するために、逐次近似の方法を使用した（１ ０）。 各亜種のＢｏｈｒ方程式からの値を別々の実験のデータから計算した。
van’t Hoffの式を使用して、p50値から酸素化の全体的な熱DH’を計算しました。 20º Cおよび15º CのBufo spinulosus limensisの価値のために周囲温度として20º Cを取って使用されました。 Bufo spinulosus trifoliumのために15º Cおよび20º Cの価値は周囲温度として15º Cを取って使用されました。 Bufo spinulosus flavolineatusのために10º Cおよび20º Cの価値は周囲温度として10º Cを取って使用されました。 統計的有意性は、ソフトウェアSystat6.0for Windowsを使用したStudentのt検定によって決定されました。
結果
表IおよびIIは、血液学的データを要約する。 ＢｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｌｉｍｅｎｓｉｓとＢｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｔｒｉｆｏｌｉｕｍの値の間に統計的差はなかった。 Ｂｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｆｌａｖｏｌｉｎｅａｔｕｓにおけるヘマトクリット，ヘモグロビンおよびＲＢＣの量の値ははるかに低い。
電気泳動実験では、三つの亜種のそれぞれのヘモグロビンにおいて同じ移動距離を示し、いくつかのランにおいて二つのバンドの存在を示した（Fig. 4). ヘモグロビン特性を定義するためのさらなる研究は行われなかった。
表IIは、血液中のヘモグロビンの機能的特性を示し、Bufo spinulosus limensisとBufo spinulosus trifoliumの間のP50の小さな違いを明らかにしたが、Bufo spinulosus flavolineatusの値は低い。 動物を採取した周囲温度での値は，ＢｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｌｉｍｅｎｓｉｓとＢｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｔｒｉｆｏｌｉｕｍの間で有意に異ならなかった。 Bufo spinulosus flavolineatusの場合、10º CでP50値は非常に低いです。 図1は対数P50対pHのプロットを示し、図2はp50とHillの係数を20℃で構成したヘモグロビン酸素解離曲線を示しています。Bufo spinulosus limensisとBufo spinulosus trifoliumの曲線は互いに非常に近いのに対し、Bufo spinulosus flavolineatusの曲線は左にシフトしています。 図3は、各亜種の周囲温度における血液O2含有量対血液PO2のプロットです。 これは、低O2含有量とBufo spinulosus flavolineatusの非常に低いP50とBufo spinulosus trifoliumの血液O2含有量の減少なしでBufo spinulosus limensisとBufo spinulosus trifoliumと比較してBufo spinulosus trifoliumの左に適度な変位を示しています。
図1.1.1. 1:Bufo spinulosusの三つの亜種におけるボーア効果。 Ｂｕｆｏｐｉｎｕｌｏｓｕｓｆｌａｖｏｌｉｎｅａｔｕｓは最大のＢｏｈｒ因子を示した。
図1.1.1. 2:7.84および20º C.のpHの三つの亜種のためのBlooddissociationsのカーブ。 Bufo spinulosus flavolineatusの曲線は左にずれています。
図1.1.1. 図3:それぞれの生態学的な温度の各亜種のためのヘモグロビンO2の内容対部分的な酸素圧力。 Bufo Spinulosus limensis(20º C),Bufo spinulosus trifolium(15º C)Bufo spinulosus flavolineatus(10º C). Bufo spinulosus flavolineatusのヘモグロビン含量は他の2つの亜種よりも低く、P50は非常に低い。
図1.1.1. 4:Bufo Spinulosusの三つの亜種の電気泳動。 この実験では、三つの亜種のそれぞれのヘモグロビンにおける同じ移動距離と、いくつかのランにおける二つのバンドの存在を示した。
これらの結果は、20℃で、自然の生息地が4000mに近く、周囲温度が平均10℃であるBufo spinulosus flavolineatusは、平均周囲高度が3000mに近く、周囲平均温度が15℃であるBufo spinulosus trifoliumと比較して、低ヘモグロビン含量と高いヘモグロビン親和性を有することを示している。 Ｂｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｌｉｍｅｎｓｉｓ（海面）とＢｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｔｒｉｆｏｌｉｕｍはほぼ同一の曲線を有していた。 曲線が周囲温度で得られた場合、Bufo spinulosus flavolineatusは、他の二つの亜種に比べて非常に低いO2含有量と高いヘモグロビン親和性を示した。 Ｂｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｆｌａｖｏｌｉｎｅａｔｕｓでは，高いＤ ｈ’は周囲温度の変化に対するヘモグロビン親和性の高い感受性を示し，高いＢｏｈｒ因子は血液ｐ ｈの変化に対するヘモグロビン親和性の高い感受性を示した。
議論
ブフォ属はアンデス諸国に広く分布している。 Bufo spinulosusには3つの亜種があり、そのニッチはアンデスの下部斜面、中間の谷（3000m）、および最も高い平野（4000m以上）に位置しています。 中間高度亜種Ｂｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｔｒｉｆｏｌｉｕｍと海面亜種Ｂｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｌｉｍｅｎｓｉｓは血液学的値に差はなかった。 高高度のBufo spinulosus flavolineatusはヘモグロビン濃度がはるかに低いが、赤血球の特性は他の2つの亜種と同様である。 Rbcは、Ruizの調査結果とは異なり、他の2つの亜種のものよりも小さいように見えます（9）、これは反対を示しています。 Bufo属は他の両生類よりもヘモグロビン濃度が高いことが知られています。 HutchinsonとSzarki(3)は、これを高い血管新生と陸上習慣に帰着させます。 しかし，Ｂｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｆｌａｖｏｌｉｎｅａｔｕｓはヘモグロビン濃度が非常に低い。
3つのグループにおいて、ヘモグロビン電気泳動研究では、電気泳動パターンが2つの明確に分離したヘモグロビンバンドを示す個体が示されている。 Bufo spinulosus trifoliumとBufo spinulosus limensisの間のヘモグロビン親和性には20℃で差はないが、Bufo spinulosus flavolineatusのそれは高い。 動物が生息する周囲温度で親和性を調べたところ，Ｂｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｔｒｉｆｏｌｉｕｍはｂｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｌｉｍｅｎｓｉｓの左に適度にシフトする酸素解離曲線を有し，Ｂｕｆｏｓｐｉｎｕｌｏｓｕｓｆｌａｖｏｌｉｎｅａｔｕｓは非常に顕著なシフトを示し，非常に高いヘモグロビン親和性を示した。
高高度在来の哺乳類や鳥類は、高い血中酸素親和性を有し、高高度では真性赤血球増加症を示さない傾向がある(5)。 周囲の低酸素症および寒冷条件に対するこれらの応答が外熱動物に存在するかどうかを観察することは興味深いであろう。 理論的には、寒冷条件は代謝率を低下させるため、高高度への耐性を高めるのに役立つはずです。 Bufo spinulosus flavolineatusの場合、4100mの岩石下の日の温度は約10℃、夜間は約6℃以下であり、半分浸漬した池では、高い親和性は代謝率の低下の可能性があるにもかかわらず、低酸素症への選択圧力を示している。 PackardとStiverson(7)は、コーラスカエル（Pseudacris triseriata）の高度とヘモグロビン濃度との関係を見つけられませんでしたが、彼らの研究の高度範囲（1500mと3000m）は小さかった。
ヘモグロビン親和性は、脊椎動物の低酸素環境によって明らかに選択された遺伝的マークである。 哺乳類および鳥類では、親和性は低酸素症では増加せず、正常酸素症では消失しないむしろ固定された特性である（6）。 魚では、他の一方で、血中酸素は低酸素症（下で著しく増加する13）。
比較の観点から、外温線と吸熱線の間にはいくつかの類似点がある。 高度勾配を占めるマウスの亜種では、ヘモグロビン親和性と高度との間にいくつかの相関があることが見出されている（11）。 また、アンデスの垂直勾配に沿って住んでいる同じ哺乳類種の中で、最も高い範囲に住んでいる個体は、最も低い範囲に住んでいる個体よりも高い親和性を有するヘモグロビンを有することが示されている。 これらの違いは、二つの別々の種が高度範囲（4）の両極端を占めるアンデスキツネの場合に大きかった。
この研究は、低酸素環境への適応パラメータとして真性赤血球増加症が選択されていないという概念を強化する。 逆に、高親和性ヘモグロビンは、高高度に住む様々な動物で強く選択されているようです。
謝辞
私たちは、このテーマに関する私たちの考えを明確にし、原稿を見直すための彼の助けのためにロイ-E-ウェーバー博士に感謝します。
対応する著者:Hrvoj Ostojic P.-Clinicum Laboratorio Automatizado,Casilla169,Iquique,Chile. 電話:(56-57)420599、ファックス:(56-57)427683、電子メール:[email protected]
受信：1999年8月13日。 改訂された形式で受け入れられました:May6,2000
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