DNAゲル電気泳動は、サイズに基づいてDNA断片を分離して同定するために使用される技術です。
様々なサイズのDNA断片は、紅藻に見られる炭水化物であるアガロースから作られた多孔質ゲルに装填される。
電界が印加されると、DNAヌクレオチド中の負に帯電したリン酸基のおかげで、断片はゲルを通って移動する。
小さなDNA断片は、大きな断片よりもゲルを通って移動しやすく、ゲルマトリックスを通って移動するのがより困難になります。
ゲルランが完了すると、DNAサンプルの位置をDNAラダーと呼ばれる既知のサイズの一連の断片またはバンドと比較することができます。
目的の断片の存在は、そのサイズに基づいて確認することができ、これは試験サンプルの相対的な位置をラダーの断片と比較することによって決定
アガロースゲルは、体積パーセント以上の重量溶液を使用して調製される。 従って緩衝の100つのmlのアガロースの1グラムは1%のゲルを作ります。 より低いパーセントのゲルはより大きい片をよりよく解決し、より高いパーセントのゲルはより小さい片を識別すること容易にする。 ゲル作りの手順を開始するには、適切な量のアガロースをErlenmeyerフラスコに計量します。
バッファの容量がフラスコの容量の1/3以下になるように、フラスコに実行中のバッファを追加します。 その後、混合するために渦巻きます。
アガロース/緩衝液混合物を最大電力でマイクロ波で加熱することにより溶融する。 三十秒ごとに、フラスコを取り出し、よく混合するために内容物を旋回させる。 アガロースが完全に溶解するまで繰り返します。
次に臭化エチジウムを0.5mg/mlの濃度に添加する。 臭化エチジウムは、DNAの個々の塩基対、またはインターカレートの間に収まる芳香族化合物であり、UV光の下で強いオレンジ色の蛍光を放出するDNAを引き起 臭化エチジウムは発癌物質であるので、この化合物を含むゲルを扱うときは常に手袋を着用する必要があることに注意することが重要です。
ゲルトレイの反りを防ぐために、65℃の水浴に入れてアガロースを冷やしてください。
アガロースが冷却されているので、ゲルトレイを鋳造装置に入れてゲルモールドを準備します。 別の方法として、テープを使用してゲルトレイの開いた端をシールして金型を作成することができます。 ゲルに櫛を置くことはDNAが荷を積まれる井戸を作成する。 櫛があなたのDNAのサンプルのための適切なサイズである井戸を作成することを確かめなさい。
溶融したアガロースをゲル型に注ぎ、室温で硬化させます。
アガロースが固まった後、櫛を取り出す。 ゲルがすぐに使用されることを行っていなかったらラップのそれを包み、使用までの4º Cで貯えて下さい。
ゲルをすぐに使用する場合は、ゲルボックスに入れてください。
この手順を開始するには、分離するDNAサンプルにゲルローディング色素を追加します。 負荷の染料は6X集中で普通なされます。 染料のロードは、サンプルを視覚化してウェルにロードするのに役立ち、実行中にサンプルがどれだけ移動したかを判断するのに役立ちます。
電源を希望の電圧に設定します。
今度はゲルの表面を覆うのに十分なランニングバッファーをゲルボックスに加えます。 ゲルを準備するのに使用されるものと同じ連続した緩衝を使用することを確かめて下さい。
ゲルボックスのリードを電源に接続して電源を入れます。 DNAは負に帯電しており、陽極に向かって移動しますが、これは正であり、一般的には赤色であることに注意してください。 ゲル箱の底に黒い鉛、か陰極を、接続しないことを確かめて下さい。 だから、黒猫は不運、または負であることを覚えておいて、忘れてはいけない、と黒カソードは、したがって、負であることを覚えておいてくださ 赤、または陽極にあなたのゲルを実行します。 ゲル箱および電源が両方働いていることを確認するため;電極の泡の出現は流れが通っていることを示します。
ゲルボックスの蓋を外します。 ゆっくりと慎重にゲルにDNAサンプルをロードします。 再度、サンプルのローディングの染料はサンプルがゲルに沈むようにし、サンプルがどこまで移動したか追跡するのを助けます。 DNAサイズマーカー、またはラダーは、常に実験サンプルと一緒にロードする必要があります。
蓋を交換します。 電極が電源の正しいスロットに差し込まれていることを再確認してください。
電源を入れます。 染料が適切な距離に移行するまでゲルを実行します。
電気泳動が完了したら、電源をオフにし、ゲルボックスの蓋を取り外します。
ゲルボックスからゲルを取り出し、ゲル表面の余分な緩衝液を排出します。 残りの連続した緩衝を吸収するためにペーパータオルにゲルの皿を置いて下さい。
DNA断片を可視化するには、ゲルをゲルトレイから取り出し、ゲルを紫外光にさらします。
DNA断片はオレンジ色の蛍光バンドとして表示されるはずです。 ゲルの写真を撮る。
実験の最後に、施設の規則に従ってゲルとランニングバッファーを適切に処分してください。 再度、臭化エチジウムの露出を避けるために手袋が付いているゲルそして連続した緩衝を常に扱うことを覚えて下さい。
今、あなたはDNAゲル電気泳動を実行する方法を見てきました。 この非常に有用な方法のいくつかの下流のアプリケーションとバリエーションを見てみましょう。
PCR産物を分離した後のアガロースゲル電気泳動結果が表示されます。 ゲル中にロードされたDNA断片は、明確に定義されたバンドとして表示されます。 DNA標準またはラダーは、サンプルバンドのサイズの有用な決定を可能にする程度に分離する必要があります。 この実施例では、７ ６ ５塩基対、８ ８ ０塩基対および１ ０ ２ ２塩基対のＤＮＡ断片を、２−ｌｏｇ ＤＮＡラダーを用いて１．
目的のDNA断片の存在を確認することに加えて、DNAゲル電気泳動とゲル精製手順を組み合わせることができます。 典型的には、剃刀の刃を使用して、関心のあるDNA断片を切り出し、それを収集し、その中のDNAサンプルを回収することができるようにする。
Agarose gel electrophesisは、dnaまたはRNAをセルロース膜に移動させ、電気泳動分離されたサンプル内の特定のDNAまたはRNA配列を同定するために放射性プローブを使用するこ
標準的なDNAゲル電気泳動は、ゲノムDNAのように、サイズが15-20kbを超える高分子量DNAの分離には理想的ではありません。 大きいDNAのサンプルを分けるためには、異なった方向の変更にゲルを服従させるか、または脈打つことを含む脈拍分野のゲルの電気泳動は使用され この技術はゲルのまわりで異なったオリエンテーションで配列される一対の電極を備えている専門にされたゲルの連続した器具を含みます。 これは、異なる微生物群集からプールされたDNAサンプルのように、生物の集団間のゲノムサイズの違いを検出するために使用することができます、あなたは別の湖の環境から採取されたここを参照してください。
DNAゲル電気泳動の紹介を見ただけです。 この方法の背後にある概念、アガロースゲルの調製方法、サンプルのロード方法、ゲルの実行方法、分析方法、アガロースゲル電気泳動の一般的な用途を示しました。 あなたのゲルを実行していると見て、幸運をありがとう。