isolering og langsiktig utvidelse av primære celler, spesielt stem/progenitorpopulasjoner, er grunnleggende og viktige grunnleggende teknikker innen ulike biologiske felt, inkludert utviklingsbiologi og stamcellebiologi, og medisinsk vitenskap. Celler i stratifisert og columnar epitelvev er svært regenerative og uforholdsmessig ansvarlige for mange humane kreftformer; kloning av voksne stamceller er imidlertid begrenset av vanskeligheter med å opprettholde disse cellene i en umoden tilstand. I de senere år har tekniske innovasjoner resultert i rask og dramatisk fremgang i stamcellebiologi, for eksempel bruk av små molekyler og vekstfaktorer for å etterligne vevsnittmiljøer og legge til rette for «Organoidkultur» .
I 1975 etablerte Rheinwald Og Green det første vellykkede eksemplet på menneskelig voksen stamcellekultur ved bruk av humane keratinocytter . Spesielt opprettholdt de humane keratinocytter på lang sikt i kombinasjon med en subletalt bestrålt musfibroblastcellelinje, 3T3-J2. Selv om De ikke brukte begrepet «stamceller» for klonede keratinocytter dyrket PÅ 3T3-celler, Fant Green og kolleger kolonier med den bemerkelsesverdige kapasiteten til å dele og danne nye kolonier etter passasje, som de kalte «Holokloner» . Disse holoklonene består av små, umodne celler som alle viste intens nukleær farging med p63, en hovedregulator av stemness, i stratifiserte epitelceller . I stratifisert epitel, inkludert hud, lungebronkier, brystkjertler og urinblære, var stamcellepopulasjonen hovedsakelig lokalisert i basallaget, og umodne celler ble farget med p63, i samsvar med in vitro-studiene . Signifikant har isolerte og utvidede humane keratinocytter fra autolog hud blitt podet for å brenne pasienter og regenerert en permanent epidermis som ligner det som skyldes split-tykkelse hudtransplantater . Spesielt har den samme prosedyren blitt brukt for å isolere og utvide humane hornhinneepitelceller for transplantasjon . Selv om Denne teknologien var begrenset til stamceller i epidermis og hornhinnen på den tiden, Skapte Green Og kolleger grunnlaget for kloning av menneskelige voksne stamceller innen grunnleggende biologi og regenerativ medisin.
i denne oversiktsartikkelen gir vi en oversikt over nyere forskningsfremgang og akkumulerende bevis på et cellekultursystem som har ført til tekniske gjennombrudd i epitelcelleteknologi. Nye kulturstrategier for både stratifiserte epitelceller og columnar epitelceller har gjort det mulig for menneskelig epitelutvikling å bli rekapitulert og kan brukes til å generere en human sykdomsmodell in vitro. Vi diskuterer også potensielle og mulige anvendelser av normale epitelcellekulturteknologier for regenerativ medisin og fremhever et kreftcellekultursystem som reproduserer individuelle pasientfenotyper.
Stratifisert epitelcellekultur
i stratifisert epitelvev, inkludert glandulært og pseudostratifisert epitel, kan p63 + – celler, som er lokalisert på kjellermembranen, selvfornyes for å opprettholde stamme / stamfarpopulasjoner og gi opphav til avkom som danner funksjonelle vev . Som nevnt ovenfor har kloning og utvidelse av epiteliale stamceller, som hudkeratinocytter og hornhinneepitelceller, vært godt etablert i ko-kultursystemer MED bestrålte mus 3t3-J2 fibroblaster. Denne standardprotokollen har imidlertid i stor grad vært begrenset til den langsiktige kulturen av keratinocytter og hornhinneceller. Likevel har klonede stamceller fra thymic epithelia blitt rapportert, som har isolering av thymic epithelial stamceller fra ulike arter, inkludert humane celler, dyrket med EN 3T3 mater system . Videre brukte Frey og kolleger NYLIG 3t3 feeder-metoden for å isolere uroteliale stamceller som uttrykte sonisk pinnsvin og bodde i det basale laget av blærens urothelium . Disse uroteliale stamceller fra isolert humant og svinvev ble stabilt dyrket PÅ ET 3t3-materlag og kunne gi opphav til flere cellelinjer, inkludert p63 + basalceller og Uroplakin 2+ og 3+ urotelceller, etter nyrekapseltransplantasjon i nakne mus. I 2011, Pooja et al. utnyttet 3t3 kultursystem for å isolere tre typer humane luftveisepiteliale stamceller, dvs. stamceller, og fant at disse luftveisepiteliale stamceller viste forskjellige cellulære fenotyper etter in vitro differensiering, selv om de umodne stamcelleklonene syntes å være morfologisk uutslettelige (Fig. 1) . I en oppfølgingsstudie viste transplantasjonen av musetrakeal og distale luftveisepitel stamceller at distale luftveisepitelceller lett ble inkorporert I H1N1 influensaskadet lungevev og differensiert til flere epitelcelletyper, dvs., bronkioler og alveoler, mens transplanterte trakeale stamceller var lokalisert bare i store luftveier . Klonogene stamceller ble også isolert fra humane spiserør endoskopiske biopsiprøver, og disse cellene var i stand til å danne godt differensierte, stratifiserte epitellignende strukturer i ET luftvæskegrensesnitt (ALI) kultursystem .
Skjematisk av cellekulturprosessen for humane stratifiserte og kolonnerte epiteliale stamceller på ET 3t3 musematerlag. For stratifiserte epiteliale stamceller isoleres de fra biopsi eller kirurgiske prøver er belagt PÅ ET 3t3-lag for en langsiktig kultur. For columnar epithelial stamceller, er de belagt PÅ EN 3T3 lag med definerte faktorer som er avgjørende for stamcellevekst og vedlikehold. Morfologisk umodne kolonier (pakket kolonier med små celler) av epiteliale stamceller blir mekanisk plukket opp for ytterligere homogen ekspansjon. I ALI kultur, cellene gjennomgå differensiering i modne celletyper I En Transwell
Schlegel og kollegaer rapporterte at En Rho-assosiert proteinkinase (ROCK) inhibitor i kombinasjon MED 3t3 materceller økte signifikant den proliferative kapasiteten til epithelial stamceller, inkludert humane keratinocytter, prostataceller og brystkjertelceller, og de kalte dette fenomenet «betinget omprogrammering». Evnen til effektivt å generere epiteliale stamcellekulturer fra pasienter gir kritisk og verdifull innsikt i cellebasert diagnostikk og terapi . Mer nylig viste Rajagopal og kollegaer At TGFß/BMP / SMAD-signalveien er viktig i forskjellige epitelvev, inkludert ektodermavledet hud-og brystkjertelvev, endodermavledet esophagus og prostatavev og mesodermavledet epididymis. De oppdaget at den doble hemmingen AV SMAD-signalering (bmp-signalet ble blokkert AV DMH-1 og tgfß signalet ble hemmet Av a-83-01) muliggjorde stabil forplantning av humane og musepiteliale basalcellepopulasjoner. Overraskende nok aktiverte dobbel tgfß / BMP-hemming den robuste utvidelsen av epithelial stamceller uten behov FOR mus 3t3-materceller.
Samlet kan disse tekniske fremskrittene, i kombinasjon med små molekyler og materceller, brukes til kontinuerlig og effektivt å utvide stratifiserte epithelial stem / progenitorpopulasjoner in vitro. Et annet gjennombrudd i stratifisert epitelkultur, organoid kultur, har blitt brukt til å utvide både basal og luminal human prostata progenitors. Disse humane luminale stamfedrene var multipotente og dannet prostatalignende strukturer in vitro . Imidlertid er det fortsatt utfordrende å generere tredimensjonale strukturer som består av stratifisert eller pseudostratifisert epitel for å rekapitulere autentisk in vivo-arkitektur, selv om mange forskere har rapportert sfæroide og organoide kulturer. Dette problemet kan løses ved å etablere en metode for å lette selvorganisering, som utført i pluripotente stamcelleavledede vev .
Søyle epitelcellekultur
selv om intestinale stamceller har den bemerkelsesverdige kapasiteten til å proliferere med høy omsetningsrate for å opprettholde tarmepitel, og hepatocytter er svært regenerative som svar på skade, er evnen til å klone stamcellepopulasjoner fra søyle epitelceller sterkt begrenset, antagelig på grunn av mangel på vevsnisjesignaler in vitro. I løpet av det siste tiåret, Clevers og kolleger oppdaget LGR5 (leucin-rik gjenta-inneholdende G-protein koblet reseptor 5), en intestinal stamcellemarkør, i en sofistikert musemodell (Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 mus krysset Med Cre-aktivert Rosa26 LacZ reporter) og etablert en mus intestinal organoid kultur metode som består av villus-lignende strukturer og krypt-lignende soner med flere tarmcelletyper . I kombinasjon med vekstfaktorer og småmolekylære cocktailer ble en isolert lgr5+ stamcellefraksjon suspendert I Matrigel og dyrket langsiktig . Ved å modifisere kulturtilstanden ved bruk av nikotinamid, en p38-og TGFß reseptorhemmer, var humane epitelceller isolert fra tynntarmen og tykktarmen i stand til uendelig å ekspandere på lang sikt in vitro . Denne teknikken er anvendelig for kultur andre typer celler, slik som bukspyttkjertelkanalceller og hepatocytter, og tilrettelagt revolusjonerende fremskritt i søyle epitelcellekultur.
Organoid kultur benytter En Matrigel-basert 3d kulturplattform og kan i stor grad brukes til å stabilt kultur ulike typer voksne epitelceller, inkludert stratifiserte epitelceller, med stamme / stamcellepopulasjoner . Imidlertid er evnen til raskt og effektivt å forplante en brøkdel av ensartede stamceller in vitro også nyttig og viktig for den detaljerte studien av selvfornyelse og skjebnespesifikasjon i vevstamceller og mulige fremtidige anvendelser av celletransplantasjon for regenerativ medisin. Xian og kolleger utviklet nylig et nytt kultursystem for homogen utvidelse av humane føtale tarmstamceller, inkludert tynntarm og kolonceller. Dette systemet benyttet ET 3t3 musematerlag i kombinasjon med vekstfaktorer og signalbanehemmere for å robust utvide humane kolonneformede epitelceller (Fig. 1) . Videre var mer enn 50% av tarmstamceller dyrket PÅ 3T3 fibroblaster i stand til å danne kolonier. I pattedyrtarmen er definerte nisjefaktorer, som Wnt og Notch-signaler, avgjørende for å styre stammen av intestinale stamceller ved kryptbasen. Videre Oppstår Panetceller, som også ligger i kryptbasen, fra stamceller og fungerer som stamcellens nisje ved å gi viktige faktorer på en parakrin måte. Fordi organoidkulturer består av stamceller og forskjellige derivater, som Panetceller, leveres nisjefaktorer autonomt . Derimot, fordi en ren populasjon av intestinale stamceller dyrkes PÅ ET 3t3 materlag, kan cellene ikke utskille nisjefaktorer. Derfor må ekstrinsiske faktorer som ligner nisjefaktorer suppleres. I TILLEGG til stamcellevedlikeholdsprotokollen er det etablert en differensieringsprotokoll i EN ALI-kulturmodell for å gi opphav til minst fire typer store tarmceller, Dvs. Panetceller, entero-endokrine celler, bobelceller og enterocytter (intestinale absorberende celler) . Dannelsen av intestinale villuslignende strukturer ble observert i henhold til de opprinnelige vevstypene, slik tynntarm og kolonvev (Fig. 1). I EN ANNEN ALI kultur tilnærming, Kuo Og kolleger robust dyrket små biter av mus neonatal tarmen med en stromal element langsiktig .
den samme strategien ble også brukt på klone humane gastriske stamceller oppnådd fra endoskopisk biopsi. Nærmere bestemt ble klonogene mageceller stabilt utvidet på ET 3t3-materlag i kombinasjon med vekstfaktorer og små molekyler og differensiert i gastrisk epitellinje som vanligvis finnes i magen, slik som pepsinogen-uttrykkende hovedceller . I tillegg til klonede fordøyelsesorganstamceller kunne oviduk-stamceller fra det distale livmorrøret også uendelig forplante seg på ET 3t3-materlag i nærvær av nisjefaktorer . Den distale ovidukten, fimbria epitel, er et enkelt kolonnert epitellag som består av følgende to typer celler: ciliated celler, som forbedrer transporten av gameter, og sekretoriske celler, som utskiller slim. Ved hjelp av en liten modifikasjon av differensieringsprotokollen for intestinale stamceller, ga langsiktige ALI-kultiverte oviductale stamceller opphav TIL EN 3d-arkitektur, som inneholdt både cilierte og sekretoriske celler, som minner om in vivo epitelstrukturen . Evnen til å produsere epitellinjer med riktige celletyper fra en stamcellepopulasjon kan være et nyttig verktøy for å studere fysiologisk epitelutvikling og homeostase og utvikle akutte og kroniske sykdomsmodeller in vitro.
Kreftcellekultur
Siden Den første kreftcellelinjen, HeLa cellelinjen, ble etablert fra en livmorhalskreft pasient i 1951 , har kreftcellelinjer etablert fra et bredt spekter av krefttyper blitt mye brukt til å studere patobiologi av kreft og gitt muligheter til å generere in vivo xenograft modeller og teste anti-kreft medisiner in vitro og in vivo. Selv om enorme fremskritt har blitt gjort i kreftbiologi ved hjelp av kreftcellelinjer, kan resultatene som er oppnådd ved bruk av disse cellene, ikke tilstrekkelig gjenspeile sykdommens kompleksitet som opprinnelig forventet fordi kreft utviser interpatient og intratumor heterogenitet, som avslørt av nyere fremskritt i neste generasjons sekvensering . For mer nøyaktig å reflektere kreftfenotyper, inkludert pasientens genmutasjonsstatus og patologi, utviklet Welm og kollegaer pasientavledede xenograft (PDX) modeller av brystkreft hos nonobese diabetiske alvorlige kombinerte immunsvikt (NOD-SCID) mus som opprettholdt de essensielle egenskapene til de opprinnelige svulstene og viste metastatisk kapasitet til bestemte steder . I tillegg til brystkreftmodellen viste etableringen av ulike typer solide svulster muligheten FOR PDX-modeller, som forventes å akselerere den prekliniske testingen av nye kreftbehandlinger og bidra til å realisere målet om «personlig medisin».
Kulturmetoder for voksne stamceller, som organoid og matersystemer, gjelder også for ulike tilnærminger som bruker pasientavledede kreftceller. Spesielt Rapporterte Clevers og kolleger at organoid kultur kan brukes til å modellere bukspyttkjertel , prostata og kolorektal kreft og viste at de opprinnelige kreftegenskapene, inkludert genetisk heterogenitet og narkotikasensitivitet, kan rekapituleres. Derfor kalte de dette systemet en «levende organoid biobank». Disse teknologiene kan også brukes til å isolere en stamcellepopulasjon fra en prekerøs lesjon, som Barretts spiserør, en forløper for menneskelig esophageal adenokarsinom . Isolerte og utvidede Barretts esophagus stamceller ble transformert ved å introdusere SV40 stort t-antigen, hTERT, og c-myc og xenograft til immunkompromitterte nsg (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mus . Som forventet forvandlet Barretts spiserørstamceller til esophageal adenokarsinomlignende svulster hos mus. En lignende tilnærming viste at humane oviduktale stamceller var opprinnelsescellen i høyverdig serøs eggstokkepitelkreft . Dette funnet bekrefter nylig human patologi og transgen musemodell bevis, som indikerte at det distale oviductale epitelet er opprinnelsesvevet for denne kreften . I KOMBINASJON MED CRISPR / Cas9-systemet ble normale kolonstamceller sekvensielt transformert ved å introdusere drivermutasjonene som ofte oppdages i kolorektal kreft . De resulterende cellene fikk lov til å danne xenografter i nyrekapselen og viste progressiv transformasjon i adenokarsinomlignende fenotyper preget av invasive og metastaserende egenskaper. Samlet sett letter evnen til å isolere og kulturceller fra tumor – og pasient-matchet normale epitelvev produksjonen av en plattform som ikke bare utfyller klassisk in vivo dyrearbeid innen kreftbiologi, men letter også pasientspesifikke genetikk og genomiske tilnærminger in vitro.
Modellering av betennelsessykdom med voksne stamceller
Modellering av menneskelig sykdom hindres av begrenset tilgjengelighet av humane syke vev. Likevel har fremskritt i voksen stamcellekultivering gjort det mulig for oss å reprodusere sykdomsfenotyper in vitro ved å utvide stamceller og utlede modne celletyper fra små humane biopsiprøver. FORDI 3d-kulturmetoder, SOM ALI og organoidkultur, gir strukturer som består av flere celletyper og ligner epitelarkitekturen observert in vivo, bør de være egnet for å studere inflammatoriske sykdommer, inkludert smittsomme og arvelige sykdommer. Spesielt er reproduksjon av sykdomsfenotypen enkel når patogenet (eller hovedårsaken) og målrettet celletype er kjent.
Pseudomembranøs kolitt (PMC) forårsakes av en uforholdsmessig økt populasjon Av Clostridium difficile (C. difficile) etter antibiotikabehandling. C. difficile er En Gram-positiv, spore-dannende bakterie, og produserer høymolekylære toksiner TcdA Og TcdB, som induserer væskesekresjon, betennelse og kolonvevskader. Kolonepitelceller differensiert fra klonogene kolonstamceller i ALI-kulturen ble utfordret med disse toksinene, noe som forårsaket ødeleggende epitelskader på en tids – og doseavhengig måte. DETTE resultatet indikerte AT 3d-kulturmodellen kan brukes til å representere c. difficile-patologi . På samme måte ble Effekten Av helicobacter pylori (h. pylori) – infeksjon, som forårsaker kronisk gastritt, magesår og kreft, studert ved mikroinjeksjon Av H. pylori i organoidkulturer. Bakterieinfiserte organoidkulturer viste økt betennelse, som nf-kB-aktivering og IL8-induksjon, OG IL8-ekspresjon var signifikant høyere i kjertel-type organoidkulturer enn i pit-type organoidkulturer .
Voksne stamceller har også blitt brukt til å modellere arvelig sykdom. Beekman og kolleger rapporterte en intestinal organoid kultur avledet fra cystisk fibrose (CF) pasienter. CF er forårsaket av mutasjoner i cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR), som vanligvis uttrykkes i epitelceller i mange organer, som lunge og fordøyelsesvev. Selv om normale intestinale organoidkulturer viste robust hevelse som respons På Forskolin, ble hevelsesresponsen ikke observert I cf organoidkulturer . Videre, når det muterte CFTR-lokus ble korrigert ved HJELP AV CRISPR / Cas9-teknologien i intestinale organoider HOS CF-pasienter, ble de korrigerte gener vist å fungere funksjonelt . Derfor gir in vitro differensiering av voksne stamceller, som ligner in vivo fenotyper med flere celletyper i kombinasjon med genredigeringsteknologier, kraftige midler for behandling av menneskelig sykdom og kan gi direkte innsikt i menneskelig patologi.
Anvendelse av epiteliale stamceller for regenerativ medisin
til tross for lovende strategier som bruker humane embryonale stamceller og induserte pluripotente stamceller for applikasjoner i regenerativ medisin, er det få kliniske studier av disse strategiene pågår, noe som delvis skyldes vanskeligheter i slektsspesifikasjon og muligheten for tumorigenese. Fordi voksne stamceller i hovedsak er forpliktet til bestemte vevstyper, er det relativt enkelt å produsere tiltenkte celletyper, og den potensielle risikoen for tumorigenese er lav. Dermed tar terapeutiske tilnærminger sikte på å bruke voksne stamceller som cellekilde for transplantasjon. Selv Om Green og kolleger etablerte human keratinocyte culture method i 1975, og de dyrkede cellene var transplantable til pasienter med brannskader eller kjemiske skader, var den langsiktige dyrking av andre typer voksne stamceller utsatt for betydelige tekniske barrierer. Som beskrevet ovenfor, nylige tekniske fremskritt overvant denne begrensningen for ulike typer epitelceller. Derfor er evnen til raskt og effektivt å utvide stamcellepopulasjoner verdifull for deres bruk i regenerativ medisin.
for eksempel har mus Lgr5 + colonic stamceller blitt utvidet i organoid kultur og transplantert inn i den skadede musekolon, og innpodet celler som var i stand til selvfornyelse og differensiert ble oppdaget selv etter 25 uker . I En annen tilnærming utnyttet Zhang K Og kolleger konstruerte voksne stamceller for en transplantasjonsstudie. Først kultiverte de vellykket hornhinneepitelceller i en tallerken uten materceller og fant da At Pax6 er en viktig transkripsjonsfaktor som skiller hornhinnestamceller (CSCs) fra hudkeratinocytter. Overraskende, Pax6-overuttrykk i keratinocytter induserte limbale stamcellelignende celler, og disse cellene kunne transplanteres inn i de skadede hornhinnene av kaniner . Fordi keratinocytter er lettere tilgjengelige Enn CSCs, kan denne metoden være anvendelig for behandling av menneskelig øyesykdom. Mer nylig, Liu et al. rapportert en attraktiv tilnærming til vevsreparasjon og regenerering som brukte endogene stamceller. I studien ble linseepiteliale stamceller (LECs) som uttrykte Pax6 og Bmi1 karakterisert og utviste regenerativt potensial in vivo. En kirurgisk kataraktfjerningsmetode som bevarer endogene LECs ble ansatt, og Disse LECs bidro til spontan regenerering av linser med visuell funksjon hos kaniner, makaker og menneskelige spedbarn. Denne metoden kan være et terapeutisk gjennombrudd for kataraktbehandling og potensielt erstatte kunstig intraokulær linseimplantasjon .
på grunn av de høye omsetningshastighetene til mange epitelceller, er transplantasjon av stamcellepopulasjoner avgjørende for langsiktig vevsvedlikehold. Teoretisk sett kan en enkelt stamcelle rekonstituere hele vev, og flere forskningsgrupper viste empirisk denne oppfatningen . Til tross for potensialet til pluripotente stamceller (PSCs), som kan gi opphav til alle celletyper, KAN PSC-avledede vevsstamceller sannsynligvis ikke opprettholdes i umoden tilstand in vitro. Derfor gir bruk av voksne stamceller for regenerativ medisin en betydelig fordel.