Onkologiske Rapporter

Introduksjon

Lungekreft Er en ondartet svulst med høyestesykdom og dødelighet over hele verden, Og forekomsten er påøkning. Omtrent 80% av sykdommen kan tilskrives ikkeikke – småcellet lungekreft (NSCLC) (1). På grunn av begrensningene for tidligdiagnostiske teknikker og mangel på tidlig spesifikk kliniskmanifestasjoner, diagnostiseres 70-80% av pasientene i avanserte stadier(2). Derfor er identifisering av asafe og effektiv narkotikabehandling FOR NSCLC avgjørende.

Nyere funn har vist at forekomst, utvikling og overføring AV NSCLC ikke bare påvirkes av bygenetiske faktorer, men at epigenetisk endring også er viktig, inkludert ikke-kodende rna med lite molekyl (ncRNA) (3). MicroRNA (miRNA), en klasse av endogenliten ncRNA med en lengde på ~21-25 baser, allment eksisterende ineukaryoter, kan identifisere mRNA av et bestemt målgen (4). Over 50% av miRNAs-genene er kartlagt I nsclc-relaterte skjøre steder eller genomiske regioner,noe som tyder på at miRNA-uttrykk kan være nært forbundet mednsclc. Som rapportert, uttrykk for et stort antall miRNAs inNSCLC viser lidelse og ubalanse av miRNAs fremme theprogression AV nsclc celle syklus, anti-apoptotisk effekt, enhancedcell invasjon og metastase av ikke-småcellet lungekreft(5).

PI3K/Akt signalveien spiller en viktig rolle i vekstfaktor-mediert celleoverlevelse. Tidligere funn har vist at forstyrrelsen I PI3K / Akt / mTOR-banen kan spilleen viktig rolle i dannelsen AV NSCLC (6). Det har også blitt rapportert at cellespredningssignalet generert av kombinasjonen av en rekke transmembranreseptorer og ligander kan aktivere signaltransduksjon AV PI3K/Akt/mTOR, som er nært forbundet mednsclc-spredning og overlevelsesstatus (7). Disse reseptorene inkluderer c-met,epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR), c-kit og insulinlignende vekstfaktorreseptor (IGF-IR).

Curcumin Er en naturlig aktiv ingrediens ekstrahertfra tørr rhizome av gurkemeie Curcuma genus plant, gurkemeie og kurcuma, med omfattende farmakologiske effekter, lav toksisitet og god toleranse, og på grunn av sin økonomiske verdi har den blitt et hotspot for leting (8). Findingsof studier med fokus på curcumin har identifisert et bredt spekter avfarmakologiske aktiviteter som anti-betennelse, anti-oksidasjon, lipid, anti-virus, anti-infeksjon,anticancer, antikoagulant, anti-leverfibrose og aterosklerose, lavtoksisitet og få bivirkninger (9-13).Effekten av curcumin på NSCLC og den underliggendemolekylære mekanismen forblir imidlertid uklar. I denne studien undersøkte weexcancereffekten av curcumin på celleproliferasjon og apoptose av human NSCLC og identifiserte et mulig forhold mellom denne effekten og miRNA-192-5p-modulert PI3K/Aktsignalvei.

Materialer og metoder

Kjemikalier

Dulbecco ‘s modified Eagle’ s medium (DMEM) og fetalcalf serum (FBS) ble kjøpt fra Gibco (Carlsbad, CA, USA) OG(Sør-Amerika). 3-(4,5-Dimetyl-thyltiazol-2-yl)-2,5 difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble kjøpt Fra Sangon Biotech (Shanghai, Kina). Apoptose Detection kit jeg ble kjøpt frabd Biovitenskap(San Jose, CA, USA). Caspase – 3 aktivitetsanalysenkit ble kjøpt fra Promega(Madison, WI, USA).

Cellekultur

Human normal NCL-H460 OG BEAS-2E lunge epithelialcells, og humane a549 lungekreftceller ble oppnådd Fra CellResource Center Av Den Andre Militære Medisinske Universitet. Disse cellene ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS (begge fromGibco), 100 e/ml penicillin og 100 µ / ml streptomycin ved 37°C og en fuktig inkubator med 5% CO2. Konsentrasjonen (5,10,20 og 40 µ) og tidsperioder (12 og 24 timer) av curcumin mot a549-celler ble undersøkt. Den kjemiskestruktur av curcumin er vist I Fig.1.

analyse Av celleviabilitet

Celler ble sådd med en tetthet på 5×103/brønn i 96-brønnplater. Kort sagt, celleviabilitetble målt VED mtt-analyse (Sangon Biotech). Ti mikroliter MTT (5mg/l) ble tilsatt i hver brønn og inkubert i 4 timer ved 37°C i ahumidifisert inkubator med 5% CO2. Dimetylsulfoksid(150 µ; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA,USA) ble lagt til hver brønn og omrørt i 20 minutter ved roomtemperatur. Absorbansen ble målt ved 450 nM ved hjelp av amicroplate reader.

Annexin v-FITC/propidiumjodid (PI)apoptoseanalyse

Celler ble sådd med en tetthet på1×106 / brønn i 6-brønnplater. Dyrkede celler ble vasket to ganger med iskald PBS og deretter farget Med Annexin V-FITC og PIusing Apoptosis Detection kit I henhold til produsentens instruksjoner (BD Biosciences). Apoptose ble analysert via flowcytometric Ved Hjelp Av CellQuest Pro (IVD) programvare (begge fra BDBiosciences).

Caspase – 3 aktiveringsanalyse

Celler ble sådd med en tetthet på 5×103/brønn i 96-brønnplater. Caspase – 3 aktivitet ble målt ved bruk av et caspase – 3 aktivitetsanalysesett i henhold til produsentens anvisninger (Promega). Ett hundre mikroliterreaksjonsbuffer med 10 µ substrat Asp-Glu-Val-Asp (DEVD) – p-nitroanilin (pNA) ble tilsatt til 10 µ proteincellelysat/brønn og inkubert ved 37°C i 6 timer. Caspase-3-aktivitetble analysert ved en absorbans på 405 nm.

celletransfeksjon

miR-192-5p, anti-mir-192-5p og negative controlmimics (Mir-NC) ble alle kjøpt fra Sangon Biotech. Cellene ble sådd i 6-brønnplater og vokst til 50-60% sammenløp priorto transfeksjon. Etterligningene ble transfisert Med Lipofectamine2000 i celler i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen Life Technologies). Gen eller protein ble isolert 24 hafter transfeksjon og brukt for revers transkripsjon-kvantitativpolymerase kjedereaksjon (RT-qPCR) eller western blot analyse,henholdsvis.

RT-qPCR

Celler ble sådd med en tetthet på 5×103 / brønn i 96-brønnplater. Totalt RNA ble ekstrahertfra cellene ved Hjelp Av TRIzol-reagens (Invitrogen Life Technologies).Konsentrasjonen RNA ble bestemt ved Bruk Av Et NanoDrop®ND – 1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA). Kvantifisering av miRNAs ble utført avet TaqMan miRNA assay kit (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA). Totalt RNA ble utsatt for forste-streng cDNA-syntese ogundersøkt ved Bruk Av Et Primeskript RT reagenssett (begge Fra Takara,Shiga, Japan). qPCR ble utført MED SYBR-Grønn PCR Master Mix (Takara) PÅ ABI 7500HT-Systemet. Primerne som brukes ihandlinger er vist I Tabell I.

Tabell i PCR-primerne som brukes ihandlinger.

Western blot analyse

Celler ble sådd med en tetthet på 5×103/brønn i 96-brønnplater. Kultiverte celler ble vasketto ganger med iskald PBS og inkubert med iskald lysisbufferfor 30 min på is. Cellevæske ble oppsamlet og sentrifugert ved 12 000 hryvnias g til 10 min ved 4°C. Den oppløselige proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk AV ET bca-proteinanalysesett(Sigma, St. Louis, MO, USA). Totale proteiner (10 µ) ble kjørt på 12% natriumdodecylsulfat (sds)-polyakrylamidgeler og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Membranene ble blokkert med tbs som inneholdt 5% ikke-fet melk til blokkeringsspesifikke bindingssteder. Membranene ble inkubert medanti-PI3K (1:1,500) og anti-Akt (1:1000) (Begge Fra Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) og anti – ③ – actin (1:500;Sangon Biotech) overnatting på 4°C. Etter å ha blitt vasket med 1% Tween-20 / PBS ble membranene inkubert med sekundærantistoffer (Tiangen, Beijing, Kina) for 2 h ved romtemperatur.Proteinene ble påvist ved bruk av forbedret kjemiluminescens(Vilber, Marne La Vallé, Frankrike).

Statistisk analyse

Statistiske analyser ble utført MED spss 19.0-programvare. Resultatene presenteres som middelmådig sd. Resultatene ble analysert ved Hjelp Av Studentens t-test eller enveisanalyse av varians (ANOVA). P< 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.

Resultater

Curcumin hemmer levedyktigheten Av A549celler

konsentrasjonene (5, 10, 20 og 40 µ) ogtidsperioder (12, 24 eller 36 timer) av curcumin mot A549-celler ble vurdert ved BRUK AV mtt-analysen. Fig.2 viser at behandling Av a549-celler i 12, 24 eller 48 h med 10, 20 og 40 µ curcumin hemmet cellens levedyktighet på adose – og tidsavhengig måte. MTT-analysen indikerte at kurcumin (20 og 40 µ) behandling i 24 eller 36 timer resulterte i ubetydelig celleviabilitet sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 2).

Curcumin induserer apoptose Av A549celler

før behandlingen ble også den apoptotiske frekvensen av kurcumin-behandlede (10, 20 eller 40 µ) a549-celler målt. Etter behandling med 20 eller 40 µ curcumin for24 timer økte apoptotisk hastighet markant i en doseavhengig måte, sammenlignet med kontrollgruppen (Fig . 3).

Curcumin induserer caspase-3-aktivitet ava549-celler

for å avgjøre om curcumin induserer caspase-3-aktivitet Av A549-celler, ble caspase-3-aktivitet målt ved bruk av acaspase-3-aktivitetsanalysesett. Caspase – 3-aktiviteten økte også betydelig på en doseavhengig måte etter curcumin (20 eller 40µ) behandling i 24 timer, sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 4). Disse resultatene indikerte at curcumin induserte apoptose I a549-celler.

miR-192-5p hemmer cellevibilitet og reduserer apoptose Av a549-celler

for å undersøke uttrykket og betydningen avmir-192-5p i humane normale lungepitel-og lungekreftceller,ble mir-192-5p relative uttrykk detektert VED HJELP AV RT-qPCR.Fig. 5A viser at miR-192-5prelativt uttrykk FOR NCL-H460-celler var relativt lavere, det ava549-celler var høyere, MED BEAS – 2e-celler som var høyest uttrykt.

for å analysere om miR-192-5p påvirket celleviabilitet og apoptose Av a549-celler, transfiserte vi miR-192 – 5pmimics til a549-celler. Cellene transfisert med miR-192-5pmimics viste en signifikant, 120 ganger økning i miR-192-5puttrykk etter 48 h transfeksjon, sammenlignet med kontroll ormiR-nc-gruppen (Fig. 5B).Overuttrykk av miR-192-5p reduserte levedyktigheten Til a549-celler, sammenlignet med kontroll-eller miR-nc-gruppen (Fig. 5C). Men overuttrykk ofmiR-192-5p indusert apoptotisk rate Av a549 celler, sammenlignet med kontroll eller miR-nc gruppe (Fig.5D).

Hemming av miR-192-5p undertrykker celleviabilitet og induserer apoptose av a549-celler

for å avgjøre om anti-miR-192-5p påvirket celleviabilitet og apoptose Av A549-celler, transfiserte vianti-miR-192-5p etterligner Til A549-celler. Uttrykket nivå ofmiR-192-5p ble oppdaget VED HJELP AV RT-qPCR etter 48 h transfeksjon.Anti-miR-192-5p etterligner effektivt undertrykt miR-192-5prelativ uttrykk For a549 celler (Fig.6A). Nedregulering av miR-192-5p fremmet cellevibilitet oghemmet apoptotisk hastighet på Henholdsvis a549-celler, sammenlignet med kontroll-eller mir-nc-gruppen (Fig.6B Og C).

Curcumin hemmer mir-192-5p genuttrykk Av A549 celler

for å avgjøre om curcumin påvirket mir-192-5pgen ekspresjon Av A549 celler, ble ekspresjonsnivået av miR-192-5pble oppdaget VED BRUK AV RT-qPCR etter behandling med curcumin i 24 timer. Fig. 7 viser at uttrykksnivået for miR-192-5p ble markert forbedret med curcumin (20 eller 40µ).

miR-192-5p hemmer effekten av curcumin på cellevibilitet og induserer apoptose Av A549-celler

for å undersøke hvordan overuttrykket av miR-192-5p påvirket effekten av curcumin på cellevibilitet og denapoptotiske frekvensen Av A549-celler, transfiserte vi miR-192-5p etterligner ia549-celler. Fig. 8 viser at kurkumin undertrykte celleviabilitet og økte apoptotisk frekvens Av a549-celler etter behandling med henholdsvis curcumin (20 µ) for24 h, sammenlignet med kontrollgruppen. Effekten av curcumin (20 µ) på celleviabilitet og den apoptotiske frekvensen av a549-celler ble markert redusert og økt med henholdsvis mir-192-5pmimics sammenlignet med curcumin-behandlede gruppen (Fig. 8A).

Inhibering av mir-192-5p undertrykker effekten av curcumin på cellevibilitet Og induserer apoptose Av A549cells

for å undersøke Hvordan nedreguleringen av miR-192-5ppåvirket effekten av curcumin på cellevibilitet og denapoptotiske frekvensen Av A549 celler, transfiserte vi anti-miR-192-5p etterligningerinto A549 celler. Fig. 9 viser at kurkumin hemmet celleviabilitet og økte apoptotisk frekvens Av a549-celler etter behandling med henholdsvis curcumin (20 µ) for24 h, sammenlignet med kontrollgruppen. Effekten av curcumin (20 µ) på cellevibilitet og teapoptotisk frekvens av a549-celler ble imidlertid markert økt og redusert med henholdsvis byanti-miR-192-5p-etterligninger sammenlignet med den kurcumin-behandlede gruppen (Fig .9A).

Curcumin hemmer PI3K/Akt proteinuttrykk Av A549 celler

å detemine om curcumin påvirket PI3K / Aktprotein ekspresjon Av A549 celler, PI3K / Akt protein ekspresjon ble påvist ved hjelp av western blot analyse etter behandling withcurcumin for 24 h.Fig. 10 viserat PI3K / Akt-proteinuttrykket ble markert forbedret med curcumin (20 eller 40 µ).

miR-192-5p retter SEG direkte MOT PI3K/Akt ofA549-celler

for å undersøke hvordan overuttrykk av miR-192-5p påvirket PI3K/Akt-proteinuttrykket Av A549-celler, wetransfected miR-192 – 5p etterligner I A549-celler. Fig. 11A og B viser at curcuminundertrykte PI3K / Akt proteinuttrykk Av A549 celler etter behandling med curcumin (20 µ) i 24 timer, sammenlignet med kontrollgruppen. Effekten av curcumin (20 µ) på pi3k/Akt proteinuttrykk Av a549 celler ble tydeligvis redusert bymiR-192-5p etterligninger, sammenlignet med curcumin-behandlet gruppe (Fig. 11C Og D).

Inhibering av miR-192-5p øker pi3k/Akt-ekspresjonen Av a549-celler

for å avgjøre om anti-miR-192 – 5p påvirket effekten av curcumin PÅ PI3K/Akt-proteinuttrykk Av A549-celler, wetransfected anti-miR-192-5p etterligner I A549-celler. Fig. 12A og B viser at curcuminundertrykte PI3K / Akt-proteinuttrykket Av a549-celler etter behandling med curcumin (20 µ) i henholdsvis 24 timer sammenlignet med kontrollgruppen. Effekten av curcumin (20 µ) PÅ PI3K/Akt-proteinuttrykk Av a549-celler ble imidlertid markant forbedret av henholdsvis anti-miR-192-5p-etterligninger, sammenlignet med den curcumin-behandlede gruppen (Fig.12C Og D).

Diskusjon

en million pasienter bukker FOR NSCLC årligover hele verden, og forekomsten AV NSCLC øker gradvis.Selv om en rekke studier de siste årene har fokusert PÅ NSCLC, er det ikke gjort store fremskritt med hensyn til behandling. Kirurgiforblir den mest effektive behandlingsmetoden, men i form avforebygging samt for patogenesen AV NSCLC videre studiermå utføres (14,15). Nylig identifiserte Liu et al at curcumin hemmer proliferasjon og signifikant induserer celleapoptotisk hastighet av magekreftceller (16). Ma et al viste atcurcumin hemmer cellevekst og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen (17). Samlet indikerte ourfindings at curcumin undertrykte celleviabilitet, indusert celleapoptose og økte caspase – 3-aktiviteten Til A549-celler.Derfor er curcumin et potensielt stoff for onkoterapi.

miRNA er en klasse av småmolekylært RNA som har en svært viktig rolle i genuttrykk regulering som nylig identifisert (18). miRNA-gener ervanligvis lokalisert i intronsegmenter av genet. Imidlertid er mirna også distribuert utenfor ikke-kodende eksoner av genet og den intergeniske regionen, som har vist seg å delta i avariety av kjente onc ogeniske veier, som p53, Bcl-2 og K-Ras(19). Det har vist seg at> 50% av definerte humane mirnaer befinner seg i de skjøre områdene av genomet, og disse skjøre områdene er ofte forbundet MED forekomsten AV NSCLC (20). Uttrykksprofiler av miRNAs er knyttet TIL utviklingenav NSCLC. miR-34c, miR-145 og miR-142 kan hemme NSCLC (5). Resultatene av denne studienindikerer at mir-192-5p relativ uttrykk FOR NCL-H460-celler varrelativt lavt, det For a549-celler var høyere, MED BEAS – 2e-cellervære den mest uttrykte. Overuttrykk av miR-192-5predusert cellens levedyktighet og økt apoptotisk hastighet påa549 celler. Nedregulering av miR-192-5p økte cellens levedyktighet og reduserte apoptotisk hastighet På a549-celler.I tillegg hemmet curcumin mir-192-5p genuttrykk Av A549celler. Imidlertid forbedret oppreguleringen av mir-192-5p-uttrykket effekten av curcumin på cellevibilitet og den apoptotiske frekvensen ava549-celler, mens nedreguleringen av miR-192 – 5p-ekspresjon reverserte effekten av curcumin På a549-celler. Våre resultater var samsvarende med andre studier. For Eksempel rapporterte Ye etal at curcumin fremmer celleapoptose ved å aktiveremir-192-5p (21). Imidlertid er de sannsynlige mekanismene for hvordan curcumin påvirker mir-192-5puttrykk uklare, og fremtidige studier for å bestemme denne effekten bør utføres.

i de senere år har EFFEKTEN AV PI3K / Aktsignalveien på menneskelig NSCLC fått mye oppmerksomhet(22). Aktivering AV PI3K / Aktsignaleringsveien er svært vanlig i human NSCLC, som kan fremme forekomst av kreft gjennom en rekke mekanismer, inkludert genmutasjoner, reduksjon av kreft suppressorgen Ptenuttrykk, PI3K mutasjon eller amplifikasjon, Akt mutasjon oramplification og onkogen reseptor aktivering (7). Aktivering av hver komponent i denne stien er hovedårsaken TIL den ugunstige prognosen FOR NSCLC,som kan føre TIL medikamentresistens av behandlingen, og dermed hemming av denne banen kan reversere legemiddelresistens og forbedrekjemoterapi og strålingseffekter in vivo (23). Dataene oppnådd i nåtidenstudien viste at curcumin undertrykte PI3K / Akt proteinuttrykk Av a549-celler. Oppregulering av miR-192-5p-uttrykkrefrainert PI3K / Akt – proteinuttrykket Av A549-celler.Nedregulering av mir-192-5p-uttrykk kan øke PI3K / Aktprotein-uttrykket For A549-celler. Xu et al har demonstrert at curcumin hemmer invasjonen og migrasjonen AV ftc133 cellvia downregulation AV PI3K/Akt signalveien i thyroidcancer celler (24). Xu et foreslo også at curcumin hemmer tumorproliferasjon av lungekreftgjennom PI3K/Akt-banen (25).Schee et al avslørte at miR-22-3p, miR-143-3p andmiR-192-5p regulert og var involvert I APC, TGFß og PI3Kpathway i kolorektale kreftceller (26).

til slutt fokuserte denne studien på effekten av kurcumin mot A549-celler, hemmet celleproliferasjon og indusert apoptose av human NSCLC gjennom oppreguleringen avmir-192-5p og undertrykkelse AV PI3K / Akt signalveien. Konklusjonene i denne studien indikerer at curcumin er apotensielt mål i behandlingen AV NSCLC. Imidlertid viste nåtid noen begrensninger da vi ikke undersøkte det detaljerteforhold mellom miR-192-5p og PI3K/Akt-banen i lungcancer celler. Ytterligere studier in vivo, kliniske og større statistiske analyser av denne studien skal utføres for å verifisere resultatene.