Braz J Med Biol Res, Mei 2004, Volume 37(5) 625-634
Het gebruik van reverse transcriptie PCR voor de diagnostiek van X-linked chronische granulomateuze ziekte
P. Agudelo-Flórez1, J. A. López1, J. Redher1, M. M. S. Carneiro-Sampaio2, B. T. Costa-Carvalho3, A. S. Grumach4 en A. Condino-Neto1
1Centro de Investigação em Pediatria, and the Departments of Pediatrics and Pharmacology, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas, Campinas, SP, Brazil
2Departamento of Immunology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.
3Disciplina of Allergy, Immunology and Rheumatology, Department of Pediatrics, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.
4 laboratório Medical Research 56, Departement Dermatologie, Faculteit der Geneeskunde,, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Abstracte Inleiding Patiënten en Methoden Resultaten Discussie Dankwoord Correspondentie en Voetnoten
Abstracte 
Chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een erfelijke aandoening van het aangeboren immuunsysteem gekenmerkt door een defect oxidatieve burst van fagocyten en de daaropvolgende aantasting van hun desinfecterende activiteit. De veranderingen in één van de NADPH-oxidase componenten beà nvloeden genuitdrukking of functie van dit systeem, leidend tot het fenotype van CGD. Defecten in gp91-Fox leiden tot X-gebonden CGD, verantwoordelijk voor ongeveer 70% van CGD gevallen. Onderzoek naar het zeer heterogene genotype van CGD-patiënten omvat mutatieanalyse, Northern blot-of Western blot-assays afhankelijk van het specifieke geval. Het doel van deze studie was om reverse transcriptie (RT)-PCR te gebruiken voor de analyse van moleculaire defecten die verantwoordelijk zijn voor X-gebonden CGD bij acht Braziliaanse patiënten en om het potentieel voor bredere toepassing op moleculaire screening in CGD te beoordelen. Totaal RNA werd bereid uit Epstein B virus-getransformeerde B-lymfocyten en omgekeerd getranscribeerd met behulp van willekeurige hexameren. Het resulterende cDNA werd PCR-versterkt door specifieke en overlappende paren van inleidingen die worden ontworpen om drie gebieden van het gen gp91-phox te versterken: exons 1-5, 3-9, en 7-13. Deze strategie ontdekte defecte gp91-Fox-expressie bij zeven patiënten. De RT-PCR-resultaten kwamen in vier gevallen overeen met de klinische voorgeschiedenis, biochemische gegevens (nitrobluetetrazolium of superoxide release assay) en beschikbare mutatieanalyse. In drie bijkomende gevallen kwamen de resultaten van RT-PCR overeen met de klinische geschiedenis en biochemische gegevens. In een ander geval was RT-PCR normaal, ondanks een klinische voorgeschiedenis die compatibel was met CGD en een defecte respiratoire uitbarsting. We concluderen dat deze nieuwe toepassing van RT-PCR analyse – een eenvoudige, economische en snelle methode-geschikt was voor het screenen van moleculaire defecten bij 7 van de 8 X-gebonden CGD patiënten.
sleutelwoorden: Superoxide, fagocyten, primaire immunodeficiëntie, respiratoire burst, neutrofielen, humaan
introductie
chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een primaire immunodeficiëntie die oorspronkelijk in 1957 werd beschreven als een klinische entiteit die mannelijke zuigelingen aantast en die destijds fatale granulomateuze ziekte van de kindertijd werd genoemd. De belangrijkste kenmerken van CGD zijn terugkerende en ernstige infecties waarbij de natuurlijke barrières van het organisme, zoals de luchtwegen en lymfeklieren, en uiteindelijk innerlijke structuren zoals de lever, milt, botten en hersenen (1-3). De geschatte incidentie van deze zeldzame ziekte is 1/250.000 levendgeborenen per jaar. De besmettingen worden over het algemeen veroorzaakt door catalase-negatieve bacteriën zoals goudhoudende Staphylococcus, Gram-negatieve bacillen, en schimmelspecies zoals Aspergillus, Candida en Nocardia (4,5).
het NADPH-oxidasesysteem genereert superoxide en andere reactieve zuurstof tussenproducten, cruciaal voor de microbicide activiteit van fagocyten. Het biochemische defect in CGD is een aantasting van de NADPH-oxidase-activiteit en het daaropvolgende onvermogen om micro-organismen te vernietigen (6). De belangrijkste componenten van het NADPH-oxidasesysteem zijn gp91-, p22-, p47-, p67-en P40-phox. Moleculaire defecten die CGD veroorzaken zijn over het algemeen te wijten aan afwezigheid, lage expressie of slecht functioneren van een van de NADPH-oxidase componenten. De X-gebonden vorm van deze ziekte wordt veroorzaakt door defecten in gp91-FOX, de zware keten van cytochroom b588, en is goed voor ongeveer 70% van alle gevallen (7,8). De autosomaal recessieve vormen worden veroorzaakt door defecten in een van de cytosolische componenten van NADPH oxidase (p47 – of P67-Fox, respectievelijk in 20 en 5% van de gevallen), of de cytochroom b588 lichte keten component (P22-Fox, 5% van de gevallen) (9,10). CGD is een zeer heterogene aandoening: meer dan 300 mutaties zijn geregistreerd in een internationaal onderhouden x-CGD database (8). De mutaties zijn grotendeels verdeeld binnen de 13 exons of op de exon / intron grenzen van het gp91-phox (CYBB) gen en bijna 200 van deze mutaties zijn uniek.
de diagnose van CGD is in het algemeen gebaseerd op de klinische kenmerken van de ziekte plus defecte NADPH-oxidase activiteit zoals aangetoond door abnormale nitrobluetrazolium (NBT), dihydrorhodamine 123, of superoxide release assays (11,12). In de gestimuleerde NBT-test vertonen normale individuen bijna 100% positieve cellen, terwijl bij CGD-patiënten minder dan 5% van de cellen positief zijn (13). Bovendien zijn cellen van patiënten met variant CGD positief, maar vertonen slechts een zeer lage activiteit (6). De NBT-test detecteert ook de dragers van X-gebonden CGD (moeders en zusters). Een definitieve moleculaire CGD diagnose wordt vastgesteld bij patiënten met een abnormale NBT test of respiratoire burst activiteit die een van de volgende kenmerken: een mutatie in gp91-, p22-, p47-, of P67-Fox; afwezig mRNA voor een van deze genen gedetecteerd door Northern blot analyse; en/of afwezig eiwit voor een van deze oxidase componenten door Western blot. Een genetische, maar niet moleculaire, diagnose kan worden vastgesteld door demonstratie van maternale neven, ooms of neven met een abnormale NBT-test of respiratoire burst (14). Aldus, vereist de vaststelling van een definitieve diagnose van deze zeldzame en hoogst heterogene ziekte complexe en dure methodes zoals een combinatie van noordelijke vlek of Westelijke vlek, en single-strand bouwpolymorfism analyse (SSCP) gevolgd door DNA die van verscheidene familieleden rangschikken, allen in laboratoria van het hoge complexiteitsonderzoek worden uitgevoerd.
de reverse transcriptie-PCR (RT-PCR) methode omvat de versterking van cDNA door PCR. Deze techniek kan gemakkelijk worden gestandaardiseerd in minder geavanceerde laboratoria. Het verstrekt informatie over genuitdrukking en voorlopige gegevens over de structuur of de grootte van mRNA van de gebrekkige component. RT-PCR is zelden gebruikt in CGD-onderzoek, beperkt tot pathofysiologiestudies (15-29). Tot op heden is het mogelijke gebruik van dit nuttige hulpmiddel voor het vaststellen van de definitieve diagnose van X-gebonden CGD, de meest voorkomende vorm, niet uitgebreid onderzocht. Het doel van deze studie was het gebruik van RT-PCR te evalueren voor het screenen van moleculaire defecten die verantwoordelijk zijn voor X-gebonden CGD, een zeldzame en mogelijk verkeerde diagnose van immunodeficiëntie, bij acht Braziliaanse patiënten.
patiënten en methoden
patiënten
de studie omvatte 8 niet-gerelateerde mannelijke Braziliaanse patiënten met waarschijnlijk X-gerelateerd CGD (2 zwarten en 6 blanken; leeftijd 2-8 jaar; lengte 88-108 cm; Gewicht 11-19 kg). De patiënten presenteerden een klinische voorgeschiedenis van recidiverende ernstige infecties zoals pneumonie, lymfadenitis, leverabces, pyodermitis en bijwerkingen van BCG-immunisatie. Ze werden doorverwezen naar ons laboratorium voor biochemische en moleculaire diagnostische evaluatie. Voorafgaand aan de studie werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van de deelnemers. De Medische School Ethische Commissie goedgekeurd het protocol in overeenstemming met het Verdrag van Helsinki en Brazilië Ministerie van Volksgezondheid, resolutie 196/96.
biochemische diagnose van CGD
de biochemische diagnose van CGD werd vastgesteld volgens de criteria van de Pan-Amerikaanse Groep voor immunodeficiënties. Een verminderde activiteit van NADPH-oxidase werd aangetoond door de NBT-slide test en/of de superoxide anion release assay met perifere bloed neutrofielen en mononucleaire leukocyten (14,30,31). Neutrofielen en mononucleaire leukocyten werden verkregen door centrifugering van bloedmonsters over een ficoll-Hypaque dichtheidsgradiënt (32).
de NBT-slidetest was gebaseerd op de reductie van NBT tot formazan door geactiveerde leukocyten (31). De test werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (30). Meer dan 95% van 200 normale neutrofielen gestimuleerd met 30 nM phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) moet in staat zijn om NBT te verminderen. Afwezige reactie of < 5% positieve cellen werd beschouwd als een aanwijzing voor een diagnose van CGD (14).
de kwantitatieve afgifte van superoxide door neutrofielen en mononucleaire leukocyten werd bepaald door een gemodificeerde cytochroom C-reductietest met dismutase-remmende werking (33-35). De hoeveelheid vrijkomende superoxide werd berekend met behulp van een extinctiecoëfficiënt van 0,21 nM/cm voor cytochroom c. de resultaten worden gerapporteerd als nmol superoxide afgegeven door 106 cellen per uur. Patiënten met CGD vertoonden minder dan 10% van de controlewaarden.
Screening moleculaire defecten verantwoordelijk voor X-gebonden CGD
B-lymfocyten van X-gebonden CGD-patiënten werden in vitro getransformeerd met Epstein B-virus (EBV) (15,16) om een overvloedige bron van nucleïnezuren voor moleculaire studies te leveren. De EBV-getransformeerde B-cellijnen reproduceren de biochemische en moleculaire defecten van CGD-patiënten (15,16,36), en elimineren de noodzaak van herhaalde bloedinzameling. Kort, perifere bloed leukocyten van X-gebonden CGD patiënten werden gekweekt met supernatants van B95-8, een EBV-producent cellijn (15,16,36,37), in RPMI 1640 medium aangevuld met warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (10%), 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicilline, en 100 µg/ml streptomycine, bij 37ºC, in een vochtige atmosfeer met 5% CO2. De levensvatbaarheid van de cellen werd gecontroleerd en de culturen werden gedurende de gehele onderzoeksperiode gehandhaafd.
RNA-monsters van EBV-getransformeerde B-cellijnen werden bereid met de Guanidine HCl-methode, gevolgd door ethanolprecipitatie en kwantificering met standaardmethoden (38,39). De cDNA-monsters werden verkregen door omgekeerde transcriptie van 2 µg totaal RNA met SuperScript II RT (GIBCO BRL) en willekeurige hexameren (15). De kwaliteit van de mRNA-monsters werd gecontroleerd door PCR-versterking van ß-actine, een constitutieve gencontrole (BP 920-943 en bp 1494-1471) (gen bank toetreding nr. NM001101).
gp91-Fox genexpressie werd bepaald door RT-PCR. Specifieke en overlappende paren primers (Gen Bank toetreding nr. Nm_000397, Tabel 1) werden gebruikt om (30 cycli) drie gp91-phox exonische gebieden te versterken: 1-5, 3-9 en 7-13. Deze strategie stelde ons in staat om alle gp91-phox exons te screenen. PCR-producten werden geanalyseerd met 2% agarose gelelektroforese en gekleurd met ethidiumbromide.
relatieve gp91-Fox genexpressie werd geanalyseerd met de Image Master Software (Pharmacia-Biotech). Het densitometrieresultaat voor doelsteekproeven werd gedeeld door het densitometrieresultaat van ß-actin, een constitutieve gencontrole, die het niveau normaliseert dat voor analyse wordt overwogen. De resultaten van RT-PCR-assays werden vergeleken met de klinische voorgeschiedenis van de patiënt, biochemische assays (NBT en/of superoxide release assay) en beschikbare mutatieanalysegegevens (http://www.sbi.org.br/Sbi2003/ index.htm).
resultaten
we bestudeerden 8 mannelijke patiënten met een klinische voorgeschiedenis van recidiverende ernstige infecties, doorverwezen naar ons laboratorium voor biochemische en moleculaire diagnose van CGD. De resultaten van de NBT-dia-tests en de test voor de afgifte van superoxide zijn weergegeven in Tabel 2. Zes van de patiënten presenteerden minder dan 5% positieve leukocyten in de NBT-slide test. Zes patiënten vertoonden een verminderde afgifte van superoxide door granulocyten en / of mononucleaire leukocyten (minder dan 10% in vergelijking met gezonde controles). Vier patiënten hadden abnormale resultaten in beide onderzoeken. Alle patiënten presenteerden ten minste één abnormale test en kregen de diagnose waarschijnlijk X-gebonden CGD. De moeder en de zus van patiënt T. B. P. presenteerden een NBT-slide test die compatibel is met de dragerstatus van X-gekoppeld CGD. Tijdens de studieperiode overleed één patiënt (G. M.) aan longontsteking.Vervolgens onderzochten we de definitieve diagnose van X-gebonden CGD door RT-PCR analyse van gp91-Fox genexpressie. De resultaten van RT-PCR-versterking met drie sets overlappende primers worden weergegeven in Tabel 2. De kwaliteit van de mRNA-steekproef werd gecontroleerd door PCR-versterking van ß-actin, een constitutieve gencontrole. In dit geval werden de verwachte normale produkten verkregen (figuren 1, 2 en 3).
in vier gevallen was het mogelijk RT-PCR-gegevens te matchen met beschikbare mutatieanalyse, elders gepresenteerd door patiënten et al. (30) of door onze groep (//www.sbi.org.br/Sbi2003/index.htm): J. E. M. presenteerde een c469 ® T overgang in exon 5, waarbij een nonsense mutatie werd voorspeld (R157X). M. F. presenteerde een onzinnige substitutie in exon 3, R (arginine) 73-Stop. R. S. toonde een 264 g®a substitutie bij de 3 ‘ splice junction van gp91-phox exon 3. De cDNA-reeks toonde een schrapping van gp91-phox exon 3, die tot een onstabiele of niet-functionele mutant gp91-phox leiden. G. G. presenteerde een defecte splitsing van gp91-phox exon 3 (de onderliggende mutatie is nog niet vastgesteld). De andere patiënten worden nog steeds onderzocht.
als geheel maakte deze strategie het mogelijk om defecte gp91-Fox-expressie te detecteren bij zeven van de acht patiënten. De RT-PCR-resultaten kwamen in vier gevallen overeen met de klinische voorgeschiedenis, biochemische gegevens (NBT-of superoxide-release assay) en beschikbare mutatieanalyse. In drie bijkomende gevallen kwamen de resultaten van RT-PCR overeen met de klinische geschiedenis en biochemische gegevens. In een ander geval was RT-PCR normaal ondanks een klinische voorgeschiedenis die compatibel was met CGD, een defecte respiratoire uitbarsting die wordt gekarakteriseerd door de NBT-test en de superoxide release assay en NBT-tests van zijn moeder en zus die compatibel waren met de X-gekoppelde CGD-draagstatus.
discussie
dit artikel rapporteert over de biochemische en genexpressiestudies van 8 niet-verwante Braziliaanse mannelijke patiënten met een klinische voorgeschiedenis van CGD, die voor gedetailleerd onderzoek naar ons laboratorium werden doorverwezen. CGD is een zeldzame erfelijke aandoening waarbij fagocytische cellen niet in staat zijn om superoxide anion en andere reactieve zuurstof tussenproducten te genereren. We stelden aanvankelijk de diagnose van waarschijnlijke X-gebonden CGD vast door middel van biochemische methoden zoals de NBT-slide testen en/of superoxide anion release assays. Onze resultaten toonden aan dat alle patiënten een verminderde NADPH-oxidase functie vertoonden en, op hun beurt, waarschijnlijk X-gebonden CGD.
beide methoden dragen op verschillende manieren bij tot de waarschijnlijke diagnose van CGD. De NBT-slide-test geeft informatie over het aantal cellen dat NBT tot formazan in het cytoplasma vermindert en de intensiteit van deze reductie. Patiënten met verschillende vormen van X-gebonden CGD vertonen dus abnormale NBT-dia-tests, waarbij de meeste cellen NBT zwak reduceren tot formazan. De NBT-slide test detecteert ook vrouwelijke dragers van X-linked CGD. De test van de superoxideversie meet de vermindering van cytochroom C door superoxide geproduceerd door geactiveerde leukocyten huidig in de reactie, die de diagnose van variant vormen van X-gebonden CGD toelaat. Beide tests kunnen gemakkelijk worden gestandaardiseerd in laboratoria met een lage complexiteit en geen van beide vereist dure apparatuur. De dihydrorhodamine 123 test is een zeer gevoelige methode voor de biochemische diagnose van CGD; nochtans, vereist het een stroomcytometer, een zeer duur instrument.
we evalueerden gp91-Fox genexpressie in EBV-getransformeerde B-lymfocyten van CGD-patiënten door middel van RT-PCR-analyse. De specifieke en overlappende paren van inleidingen werden gebruikt om drie gebieden van het gp91-phox gen door RT-PCR te versterken: exons 1-5, 3-9, en 7-13. Deze strategie liet de detectie van defecte gp91-Fox-expressie toe bij 7 van de 8 patiënten. De RT-PCR-resultaten kwamen in vier gevallen overeen met de klinische voorgeschiedenis, biochemische gegevens (NBT-of superoxide-release assay) en beschikbare mutatieanalyse. In drie bijkomende gevallen kwamen de resultaten van RT-PCR overeen met de klinische geschiedenis en biochemische gegevens.
gp91-Fox genexpressie was verminderd in alle exonische gebieden van de R. B.-patiënt deze vermindering kan het resultaat zijn van mutaties die leiden tot een lage RNA-stabiliteit of een veranderde transcriptionele activiteit. Patiënten G. M. en T. P. toonde afwezige expressie van exons 7-13, wat suggereert dat de verminderde expressie van deze extra 3′-end exons het resultaat kan zijn van RNA instabiliteit of een splicing defect, bijvoorbeeld, gedeeltelijk correct splicing om een signaal te produceren, maar gedeeltelijk abnormaal splicing om een primer binding site te elimineren, een onderwerp dat moet worden onderzocht door toekomstige genomische DNA mutatieanalyses.
patiënt G. G. presenteerde een diffuus, laag abundant, kleiner product van exons 1-5 (figuur 1), en geen expressie van andere exonische gebieden. Zijn mutatie analyse toonde een defect aan op de exon 3 splice locatie. De mutatieanalyse van patiënt R. S. toonde ook een defect aan op de exon 3 splice site. Nochtans, in dit geval, kon een minder overvloedig PCR-product worden ontdekt.
patiënt M. F. vertoonde verminderde expressie van exonische gebieden 3-9 en 7-13, wat het resultaat kan zijn van defecte transcriptionele activiteit in exon 3. J. E. M. presenteerde een nonsense mutatie in exon 5 die resulteerde in verlies van gp91-Fox expressie, zoals blijkt uit RT-PCR analyse, een mogelijk gevolg van nonsense-gemedieerde mRNA instabiliteit.
in één geval, patiënt T. P. B., gp91-phox gen expressie was normaal ondanks een familiegeschiedenis compatibel met CGD en een defecte respiratoire burst activiteit. In dit geval was de diagnose van waarschijnlijk X-gebonden CGD gebaseerd op abnormale NBT-tests bij zijn moeder en zijn zus, compatibel met de draagstatus. We veronderstellen dat een puntmutatie, zoals een enkele Base-substitutie die de lengte of abundantie van PCR-fragmenten niet verandert, in dit specifieke geval moet worden onderzocht.
RT-PCR is een krachtig hulpmiddel om genexpressie te beoordelen. Dit kenmerk kan gedeeltelijk de variabiliteit van gp91-phox genexpressie onder de patiënten in deze studie verklaren, en het belang om overlappende paar primers te combineren om de volledige lengte van de boodschap te screenen. RT-PCR is gebruikt in geïsoleerde case studies als onderdeel van de initiële diagnose van de verschillende vormen van CGD (17-22). RT-PCR-analyse was ook nuttig bij de prenatale diagnose van CGD, als gevolg van P47-foxdeficiëntie (23). Nochtans, is het meer algemeen gebruikt voor de studie van genregulering van de componenten NADPH-oxidase in een verscheidenheid van cellen (15,16,24-29). Tot op heden is het mogelijke gebruik van dit nuttige hulpmiddel voor het vaststellen van de definitieve diagnose van X-gebonden CGD, de meest voorkomende vorm, niet uitgebreid onderzocht. Verdere studies moeten worden uitgevoerd om de gevoeligheid en specificiteit van deze test te vergelijken met andere complexe analyses zoals Westelijke of Noordelijke vlekken.
in het algemeen hebben we aangetoond dat RT-PCR, een eenvoudige en goedkope methodologie, de definitieve diagnose van X-gebonden CGD in 7 van de 8 gevallen heeft vastgesteld, zonder de noodzaak om complexe en dure methoden te gebruiken zoals Northern blot, slot blot, SSCP-analyse of genomic DNA sequencing. Aldus, kan RT-PCR een geschikt hulpmiddel voor het diagnosticeren van CGD in laboratoria in ontwikkelingslanden zijn. Het is zeer belangrijk om het definitieve moleculaire genetische defect te bepalen om de juiste genetische counseling en prognose te bieden aan bloedverwanten met CGD. Daarnaast zullen moleculaire genetische studies van het menselijke NADPH-oxidase systeem de kennis over dit cruciale en oude verdedigingsmechanisme bevorderen.
2. Landing BH & Shirkey HS (1957). Een syndroom van terugkerende infectie en infiltratie van de ingewanden door gepigmenteerde lipide histiocyten. Kindergeneeskunde, 20: 431-442.
3. Patterson EL, Milstrey R & Stokstad ELR (1975). Effect van selenium bij het voorkomen van exsudatieve diathese bij kuikens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 95: 617-620.
5. Forrest CB, Forehand JR, Axtell RA, Roberts RL & Johnston Jr RB (1988). Klinische kenmerken en huidige behandeling van chronische granulomateuze ziekte. Hematologie / Oncologie klinieken van Noord-Amerika, 2: 253-266.
6. Curnutte JT (1993). Chronische granulomateuze ziekte: het oplossen van een klinisch raadsel op moleculair niveau. Klinische Immunologie en immunopathologie, 67: S2-S15.
7. Dinauer MC, Orkin SH, Brown R, Jesaitis AJ & Parkos CA (1987). Het glycoproteïne gecodeerd door de X-gebonden chronische granulomateuze ziekte locus is een component van het neutrofiel cytochroom B-complex. Natuur, 327: 717-720.
9. Clark RA, Malech HL, Gallin JI, Nunoi H, Volpp BD, Pearson DW, Nauseef WM & Curnutte JT (1989). Genetische varianten van chronische granulomateuze ziekte: prevalentie van deficiënties van twee cytosolic componenten van het NADPH oxidase systeem. New England Journal of Medicine, 321: 647-652.
10. Cross AR, Noack D, Rae J, Curnutte JT & Heyworth PG (2000). Hematologisch belangrijke mutaties: de autosomaal recessieve vormen van chronische granulomateuze ziekte (eerste update). Blood Cells, moleculen and Diseases, 26: 561-565.
11. Smith RM & Curnutte JT (1991). Moleculaire basis van chronische granulomateuze ziekte. Bloed, 77: 673-686.
12. Vowells SJ, Fleisher TA, Sekhsaria s, Alling DW, Maguire te & Malech HL (1996). Genotype-afhankelijke variabiliteit in flowcytometrische evaluatie van verminderde nicotinamide-adeninedinucleotide-fosfaatoxidasefunctie bij patiënten met chronische granulomateuze ziekte. Journal of Pediatrics, 128: 104-107.
15. Condino-Neto a & Newburger PE (1998). NADPH oxidase activiteit en cytochroom b558 inhoud van humaan Epstein-Barr virus getransformeerde B lymfocyten correleren met expressie van genen coderen componenten van het oxidasesysteem. Archives of Biochemistry and Biophysics, 360: 158-164.
16. Condino-Neto a & Newburger PE (2000). Interferon-gamma verbetert de splicing efficiency van CYBB gen transcripten in een interferon-responsieve variant van X-gebonden chronische granulomateuze ziekte als gevolg van een splice site consensus regio mutatie. Bloed, 95: 3548-3554.
19. Bonizzato A, Russo MP, Donini M & Dusi s (1997). Identificatie van een dubbele mutatie (D160V-K161E) in het p67foxgen van een patiënt met chronische granulomateuze ziekte. Biochemical and Biophysical Research Communications, 231: 861-863.
21. Noack D, Heyworth PG, Newburger PE & Cross AR (2001). Een ongewone intronische mutatie in het CYBB-gen die leidt tot chronische granulomateuze ziekte. Biochimica et Biophysica Acta, 1537: 125-131.
22. Roesler J, Curnutte JT, Rae J, Barrett D, Patino P, Chanock SJ & Goerlach A (2000). Recombinatie gebeurtenissen tussen het P47-Fox gen en zijn zeer homologe pseudogenes zijn de belangrijkste oorzaak van autosomaal recessieve chronische granulomateuze ziekte. Bloed, 95: 2150-2156.
23. De Boer M, Singh V, Dekker J, Di Rocco M, Goldblatt D & Roos D (2002). Prenatale diagnose in twee families met autosomale, P47(Fox)-deficiënte chronische granulomateuze ziekte als gevolg van een nieuwe puntmutatie in NCF1. Prenatale Diagnose, 22: 235-240.
24. Baehner RL, Millar-Groff s & Bringas P (1999). Ontwikkelingsexpressie van NADPH phagocytic oxidase componenten in muizenembryo ‘ s. Pediatric Research, 46: 152-157.
25. Banerjee R, Anguita J, Roos D & Fikrig E (2000). Cutting edge: infectie door de agent van menselijke granulocytic ehrlichiosis voorkomt de respiratoire uitbarsting door down-regulerende gp91phox. Journal of Immunology, 164: 3946-3949.
26. Bayrakutan U, Blayney L & Shah AM (2000). Moleculaire karakterisatie en lokalisatie van de nad (P)H oxidase componenten gp91-phox en P22-phox in endothelial cellen. Arteriosclerose, Thrombosis and Vascular Biology, 20: 1903-1911.
27. Cobbs S, Malech HL, Leto TL, Freeman SM, Blaese RM, Gallin JI & Lomax KJ (1992). Retrovirale expressie van recombinant p47fox-eiwit door Epstein-Barr virus-getransformeerde B-lymfocyten van een patiënt met autosomale chronische granulomateuze ziekte. Blood, 79: 1829-1835.
28. Gorlach A, Brandes RP, Nguyen K, Amidi M, Dehghani F & Busse R (2000). Een gp91phox die NADPH-oxidase bevat selectief uitgedrukt in endothelial cellen is een belangrijke bron van zuurstofradicale generatie in de slagaderlijke muur. Circulation Research, 87: 26-32.
29. Rouzaut A, Lopez-Moratalla N & de Miguel C (2000). Differentiële genexpressie in de activering en rijping van menselijke monocyten. Archives of Biochemistry and Biophysics, 374: 153-160.
31. Ochs HD & Igo RP (1973). De NBT slide test: een eenvoudige screeningmethode voor het opsporen van chronische granulomateuze ziekte en vrouwelijke dragers. Journal of Pediatrics, 83: 77-82.
32. Boyum A (1968). Isolatie van mononucleaire cellen en granulocyten uit menselijk bloed. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 21 (Suppl 97): 1-77.
33. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1993). Neutrofielen en mononucleaire cellen van patiënten met chronische granulomateuze ziekte geven stikstofmonoxide vrij. British Journal of Clinical Pharmacology, 35: 485-490.
35. Condino-Neto A, Muscara MN, Grumach AS, Bellinati-Pires R, Brandao AC, Carneiro-Sampaio MMS & de Nucci G (1996). Het effect van recombinant humaan interferon-gamma therapie op de afgifte van neutrofielen en mononucleaire cel stikstofmonoxide door patiënten met chronische granulomateuze ziekte. Tijdschrift voor Interferononderzoek en Cytokineonderzoek, 16: 357-364.
36. Volkman DJ, Buescher ES, Gallin JI & Fauci AS (1984). B cellijnen als modellen voor erfelijke fagocytaire ziekten: superoxide generatie in chronische granulomateuze ziekte en korrels in Chediak-Higashi syndroom. Journal of Immunology, 133: 3006-3009.
37. Nilsson K, Klein G, Henle W & Henle G (1971). De oprichting van lymfoblastoïde cellijnen uit volwassen en foetale humane lymfoïde weefsel en zijn afhankelijkheid van EBV. International Journal of Cancer, 8: 443-450.
39. Subrahmanyam YVBK, Baskaran N, Newburger PE & Weissman SM (1999). Een modified method for the display of 3 ‘ – end restriciton fragments of cDNAs: Molecular profiling of Gen expression in neutrophils. Methods in Enzymology, 303: 272-297.
Dankbetuigingen
de auteurs danken de patiënten en hun families voor hun deelname en voor hun hulp, en de verpleegkundige Silvana Severino voor technische bijstand. De auteurs danken ook Prof. Peter Newburger, University of Massachusetts Medical School, voor een kritisch overzicht van dit manuscript.
correspondentie en voetnoten