elektroforeza w żelu DNA jest techniką stosowaną do oddzielania i identyfikacji fragmentów DNA na podstawie wielkości.
fragmenty DNA o różnych rozmiarach są ładowane do porowatego żelu wykonanego z agarozy – węglowodanu występującego w czerwonych alg.
po przyłożeniu pola elektrycznego fragmenty będą migrować przez żel, dzięki ujemnie naładowanym grupom fosforanowym w nukleotydach DNA.
mniejsze kawałki DNA łatwiej migrują przez żel niż większe fragmenty, które mają trudniejszy czas poruszania się przez matrycę żelową.
po zakończeniu biegu żelu lokalizację próbek DNA można porównać do serii fragmentów lub pasm o znanych rozmiarach, zwanych drabiną DNA.
obecność interesującego cię fragmentu może zostać potwierdzona na podstawie jego wielkości, która jest określana przez porównanie względnej lokalizacji próbki testowej z fragmentami drabiny.
żele Agarozowe przygotowuje się przy użyciu roztworu procentowego o masie powyżej objętości. Tak więc 1 gram agarozy w 100 ml buforu tworzy 1% żelu. Żele o niższym procentach lepiej rozwiązują większe fragmenty, a żele o wyższym procentach ułatwiają identyfikację mniejszych fragmentów. Aby rozpocząć procedurę wytwarzania żelu, należy zważyć odpowiednią masę agarozy do kolby Erlenmeyera.
dodać bufor roboczy do kolby, tak aby objętość bufora nie była większa niż 1/3 pojemności kolby. Następnie wiruj, aby wymieszać.
roztopić mieszaninę agarozową / buforową przez podgrzanie w kuchence mikrofalowej przy maksymalnej mocy. Co trzydzieści sekund wyjąć kolbę i zawirować zawartość, aby dobrze wymieszać. Powtarzać aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy.
następnie dodać bromek etydyny do stężenia 0,5 mg / ml. Bromek etydyny jest związkiem aromatycznym, który pasuje do poszczególnych par zasad DNA lub interkalanów i powoduje, że DNA emituje intensywną pomarańczową fluorescencję w świetle UV. Ważne jest, aby pamiętać, że bromek etydyny jest czynnikiem rakotwórczym, dlatego rękawice należy zawsze nosić podczas obchodzenia się z żelami zawierającymi ten związek.
aby zapobiec wypaczeniu się tacy z żelem, pozwól ostygnąć agarozie, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 65ºC.
gdy agaroza chłodzi się, przygotuj formę żelową, umieszczając tacę żelową w aparacie odlewniczym. Alternatywnie można użyć taśmy do uszczelnienia otwartych krawędzi tacy żelowej, aby utworzyć formę. Umieszczenie grzebienia w żelu tworzy studnie, w których ładowane jest DNA. Upewnij się, że grzebień stworzy studnię o odpowiednim rozmiarze dla próbki DNA.
wlej stopioną agarozę do formy żelowej i pozwól jej stwardnieć w temperaturze pokojowej.
po stwardnieniu agarozy wyjmij grzebień. Jeśli żel nie zostanie zużyty natychmiast, należy go owinąć folią i przechowywać w temperaturze 4ºC do czasu użycia.
jeśli żel ma być użyty natychmiast, umieść go w pudełku z żelem.
aby rozpocząć tę procedurę, dodaj barwnik ładujący żel do oddzielonych próbek DNA. Ładowanie barwnika odbywa się zwykle w stężeniu 6X. Ładowanie barwnika pomaga wizualizować i ładować próbki do studni i pomaga określić, jak daleko próbki migrowały podczas biegu.
Ustaw zasilanie na żądane napięcie.
teraz dodaj wystarczającą ilość bufora roboczego do pudełka z żelem, aby pokryć powierzchnię żelu. Upewnij się, że używasz tego samego bufora do biegania, co ten używany do przygotowania żelu.
Podłącz przewody skrzynki żelowej do zasilacza i włącz ją. Pamiętaj, że DNA jest naładowane ujemnie i będzie poruszać się w kierunku anody, która jest dodatnia, i ogólnie w kolorze czerwonym. Upewnij się, że nie podłączasz czarnego przewodu ani katody do dna pudełka żelowego. Więc nie zapominajcie, pamiętajcie, że czarne koty mają pecha, albo negatywne, a czarna katoda jest zatem ujemna. Uruchom żel na czerwony, lub anodę. Aby sprawdzić, czy zarówno pudełko żelowe, jak i zasilacz działają; pojawienie się pęcherzyków na elektrodach wskazuje, że prąd przechodzi.
Usuń pokrywę pudełka żelowego. Powoli i ostrożnie załaduj próbki DNA do żelu. Ponownie, barwnik ładujący w próbce pozwala próbce zanurzyć się w żelu i pomoże śledzić, jak daleko próbka przebyła. Znacznik rozmiaru DNA lub drabina powinny być zawsze ładowane wraz z próbkami doświadczalnymi.
Wymień pokrywę. Sprawdź dokładnie, czy elektrody są podłączone do odpowiednich gniazd w zasilaczu.
włącz zasilanie. Uruchom żel, aż barwnik przeniesie się na odpowiednią odległość.
po zakończeniu elektroforezy wyłącz zasilanie i zdejmij pokrywę pudełka żelowego.
wyjąć żel z pudełka z żelem i odsączyć nadmiar buforu na powierzchni żelu. Umieść tacę żelową na ręcznikach papierowych, aby wchłonąć pozostały bufor do biegania.
aby zobrazować fragmenty DNA, wyjąć żel z tacy i wystawić żel na działanie światła ultrafioletowego.
fragment DNA powinien pojawić się jako pomarańczowe paski fluorescencyjne. Zrób zdjęcie żelu.
po zakończeniu eksperymentu należy odpowiednio usunąć żel i bufor uruchamiający zgodnie z przepisami instytucji. Ponownie, pamiętaj, aby zawsze obsługiwać żel i bufory do biegania w rękawiczkach, aby uniknąć narażenia na bromek etydyny.
teraz, gdy widziałeś, jak wykonać elektroforezę żelu DNA. Przyjrzyjmy się kilku zastosowaniom i odmianom tej bardzo użytecznej metody.
tutaj widzisz wynik elektroforezy żelu agarozowego po oddzieleniu produktów PCR. Fragmenty DNA załadowane do żelu są widoczne jako wyraźnie określone pasma. Standard DNA lub drabina powinny być oddzielone w stopniu, który pozwala na użyteczne określenie wielkości pasm próbki. W tym przykładzie fragmenty DNA 765 par zasad, 880 par zasad i 1022 par zasad są oddzielone na 1,5% żelu agarozowym z drabiną DNA 2-log.
oprócz potwierdzenia obecności interesującego fragmentu DNA, elektroforezę żelu DNA można łączyć z procedurami oczyszczania żelu. Zazwyczaj ostrze brzytwy jest używane do wycięcia fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania, tak aby można go było pobrać i odzyskać próbkę DNA w nim znajdującą się.
elektroforeza w żelu agarozowym może być również połączona z transferem blotting, który polega na umożliwieniu DNA lub RNA przeniesienia do błony celulozowej, gdzie radioaktywne sondy mogą być użyte do identyfikacji określonych sekwencji DNA lub RNA w elektroforetycznie oddzielonej próbce.
Standardowa elektroforeza w żelu DNA nie jest idealna do oddzielania DNA o dużej masie cząsteczkowej większej niż 15-20 kb, jak dna genomowe. Aby oddzielić duże próbki DNA, stosuje się elektroforezę żelu w polu pulsacyjnym, która polega na poddaniu żelu zmieniającemu się lub pulsującemu polowi elektrycznemu w różnych kierunkach. Technika ta polega na specjalistycznym aparacie do biegania żelem, który ma pary elektrod ułożonych w różnych orientacjach wokół żelu. To może być użyte do wykrycia różnic w rozmiarach genomu pomiędzy populacjami organizmów, takich jak połączone próbki DNA z różnych społeczności mikrobiologicznych, które są pobrane z różnych środowisk jeziornych.
właśnie widziałeś wprowadzenie do elektroforezy żelu DNA. Pokazaliśmy ci koncepcję metody, jak przygotować żel agarozowy, jak załadować próbki, jak uruchomić żel i przeanalizować go oraz kilka typowych zastosowań elektroforezy żelu agarozowego. Dzięki za oglądanie i powodzenia w prowadzeniu żelu.