powinowactwo hemoglobiny do tlenu u trzech podgatunków ropuch (Bufo Sp.) mieszkających na różnych wysokościach
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA Cifuentes3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratorio de Transporte de Oxígeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
streszczenie
powinowactwo tlenowe krwi i właściwości krwinek czerwonych mierzono w trzech podgatunkach rodzaju Bufo: bufo SPINULOSUS limensis, zebranych na poziomie morza i w średniej temperaturze dnia 20ºC; Bufo spinulosus trifolium, od 3100 m, średnia temperatura dzienna 15ºC; i Bufo spinulosus flavolineatus, od 4100 m, średnia temperatura dzienna 10ºC. Elektroforeza hemoglobiny wykazała ten sam składnik w każdym z trzech podgatunków. W temperaturze 20ºC powinowactwo tlenowe krwi (P50) wykazało niewielkie różnice między Bufo spinulosus limensis i Bufo spinulosus trifolium, podczas gdy wartość Bufo spinulosus flavolineatus była znacznie niższa. W temperaturze 10ºC, Temperatura otoczenia Bufo spinulosus flavolineatus, P50 był wyjątkowo niski w porównaniu z pozostałymi dwoma podgatunkami w odpowiednich temperaturach otoczenia.
słowa kluczowe: adaptacje, wysokość, Płazy, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, powinowactwo do hemoglobiny, hematokryty, wiązanie tlenu, ropuchy
wprowadzenie
w Peru Rodzaj Bufo zajmuje gradient wysokości od poziomu morza do ponad 4000 m. Gatunek Bufo spinulosus ma trzy podgatunki, których nisze znajdują się na niskich, średnich i dużych wysokościach. Te podgatunki to Bufo spinulosus limensis (niska wysokość), Bufo spinulosus trifolium (średnia wysokość) i Bufo spinulosus flavolineatus (wysoka wysokość) (12). Jedną z najintensywniej badanych adaptacji środowiskowych układu oddechowego u kręgowców jest niedotlenienie, które występuje różnie na dużych wysokościach, w rozwoju embrionalnym (np. w macicy) oraz w środowisku wodnym, zwłaszcza słodkiej wody. Adaptacje te często wiążą się ze zmianami we właściwościach czerwonych krwinek, w zdolności przenoszenia tlenu lub powinowactwie hemoglobiny do tlenu. Adaptacje wewnątrzspecyficzne, które występują w tym samym zwierzęciu w różnych warunkach, zazwyczaj obejmują zmiany czynników allosterycznych (tj. warunki, w których funkcje hemoglobiny wewnątrz krwinek czerwonych), natomiast adaptacje międzygatunkowe, które są widoczne przy porównywaniu różnych gatunków, są przypisywane zmianom we właściwościach cząsteczek hemoglobiny.
większość badań nad niedotlenieniem adaptacji czerwonych krwinek i właściwości hemoglobiny odnosi się do ryb i ssaków, a bardzo niewiele wiadomo o niższych ektotermicznych kręgowcach. Wcześniejsze badania wykazały, że żaba Titicaca Telmatobius culeus (2) żyjąca na wysokości 3800 m n. p. m. miała wyższe powinowactwo do krwi O2 i mniejsze komórki krwi niż żaby na poziomie morza. W opracowaniu tym opisano adaptacje podgatunków Bufo.
materiał i metody
Anurany podgatunku Bufo spinulosus limensis zostały zebrane z przybrzeżnych równin w odległości około 400 km od naszego laboratorium w Limie (poziom morza, średnia dzienna temperatura 20ºC). Bufo spinulosus trifolium zebrano w centralnych Andach peruwiańskich (około 3100 m, średnia temperatura dnia 15ºC), a Bufo spinulosus flavolineatus również w Andach centralnych (4100 m, średnia temperatura dnia 10ºC). Zwierzęta zostały przywiezione do naszego laboratorium w ciągu kilku godzin. Krew pobierano w strzykawkach z heparyną z serc zwierząt wcześniej karmionych. Z Bufo spinulosus limensis można było uzyskać około 3 ml krwi, a z pozostałych podgatunków od 1 do 1,5 ml. W celu przeprowadzenia oznaczeń pobrano krew od dwóch do trzech zwierząt. Liczbę krwinek czerwonych, stężenie hemoglobiny i hematokrytów mierzono za pomocą konwencjonalnych technik.
elektroforezę hemoglobiny przeprowadzono na paskach octanu celulozy w buforze specyficznym dla elektroforezy hemoglobiny, a pasma zabarwiono Ponceau S i odczytano w densytometrze zgodnie z instrukcją obsługi Helena Laboratories (USA).
powinowactwo krwi do tlenu (P50) mierzono techniką mieszania (1,10) w temperaturze 10ºC, 15ºC i 20ºC. Równoważenie krwi przeprowadzono w tonometrze utrzymywanym w tych temperaturach przy użyciu mieszanin gazów zawierających 4,5% CO2 i zmiennych stężeń O2 i N2. Nasycenie krwi O2 wahało się od 30 do 80%. PH-metr został skalibrowany przy użyciu bardzo precyzyjnych buforów fosforanowych.
wartości pH w temperaturach równowagi (eq) obliczono z tych w temperaturach pomiaru (meas) przy użyciu równania podanego przez Rosenthala (8):
pHeq = pH meas + 0,0147 (Teq _ Tmeas)
współczynnik Bohra uzyskano przez zmianę pH krwi w następujący sposób. Osocze wytworzone z wydzielin krwi zakwaszono kwasem mlekowym lub alkalinizowano wodorotlenkiem sodu i odtworzono odpowiednimi krwinkami czerwonymi. Próbki krwi Bufo spinulosus limensis i Bufo spinulosus trifolium równoważono w temperaturze 20ºC i 15ºC, a krew Bufo spinulosus flavolineatus w temperaturze 20ºC i 10ºC oraz przy różnych wartościach pH w celu obliczenia współczynnika Bohra dla każdej temperatury (14). Czynnik ten pozwolił na obliczenie standardowego pH krwi w trzech temperaturach. W celu obliczenia współczynnika Hilla (n) zastosowano metodę kolejnych przybliżeń (10). Wartość z równania Bohra dla każdego podgatunku obliczono na podstawie danych w oddzielnych eksperymentach.
do obliczenia całkowitego ciepła utlenienia DH’ z wartości P50 wykorzystano równanie van ’ t Hoffa. Dla Bufo spinulosus limensis zastosowano wartości w temperaturze 20ºC i 15ºC, przyjmując 20ºC jako temperaturę otoczenia. Dla Bufo spinulosus trifolium zastosowano wartości w temperaturze 15ºC i 20ºC, przyjmując 15ºC jako temperaturę otoczenia. W przypadku Bufo spinulosus flavolineatus wartości w temperaturze 10ºC i 20ºC zastosowano przyjmując 10ºC jako temperaturę otoczenia. Istotność statystyczna została określona przez test studenta T z oprogramowaniem Systat 6.0 Dla Windows.
wyniki
tabele I I II podsumowują dane hematologiczne. Nie ma statystycznej różnicy między wartościami Bufo spinulosus limensis i Bufo spinulosus trifolium. Wartości hematokrytu, hemoglobiny i ilości RBC w Bufo spinulosus flavolineatus są znacznie niższe.
eksperymenty elektroforezy wykazały takie same odległości migracji w hemoglobinach każdego z trzech podgatunków i obecność dwóch pasm w niektórych przebiegach (Fig. 4). Nie przeprowadzono dalszych badań w celu określenia właściwości hemoglobiny.
tabela II przedstawia właściwości funkcjonalne hemoglobiny we krwi, ujawniając niewielkie różnice w P50 między Bufo spinulosus limensis i Bufo spinulosus trifolium, podczas gdy wartość Bufo spinulosus flavolineatus jest niższa. Wartości w temperaturze otoczenia, w którym pobierano zwierzęta, nie różniły się znacząco między Bufo spinulosus limensis a Bufo spinulosus trifolium. W przypadku Bufo spinulosus flavolineatus w temperaturze 10ºC wartość P50 jest bardzo niska. Fig. 1 przedstawia wykres log P50 vs. pH. fig. 2 pokazuje krzywe dysocjacji tlenu hemoglobiny zbudowane z wartości P50 i współczynnika Hilla w temperaturze 20 ° C. krzywe dla Bufo spinulosus limensis i Bufo spinulosus trifolium są bardzo blisko siebie, podczas gdy dla Bufo spinulosus flavolineatus jest przesunięty w lewo. Rysunek 3 przedstawia wykres zawartości krwi O2 w porównaniu do krwi PO2 w temperaturze otoczenia każdego podgatunku. Pokazuje to niską zawartość O2 i bardzo niską zawartość P50 Bufo spinulosus flavolineatus oraz umiarkowane przemieszczenie na lewo od Bufo spinulosus trifolium w porównaniu do Bufo spinulosus limensis bez zmniejszenia zawartości O2 we krwi w Bufo spinulosus limensis i Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1: efekt Bohra u trzech podgatunków Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus wykazuje największy czynnik Bohra.
Fig. 2: krzywa dysocjacji krwi dla trzech podgatunków przy pH 7,84 i 20ºC. Krzywa Bufo spinulosus flavolineatus przesunięta jest w lewo.
Fig. 3: zawartość hemoglobiny O2 vs częściowe ciśnienie tlenu dla każdej podgatunku w odpowiedniej temperaturze ekologicznej. Bufo Spinulosus limensis( 20 ° C), Bufo spinulosus trifolium (15 ° C) Bufo spinulosus flavolineatus (10 ° C). Zawartość hemoglobiny Bufo spinulosus flavolineatus jest niższa niż u dwóch pozostałych podgatunków, a P50 jest bardzo niska.
Fig. 4: elektroforeza trzech podgatunków Bufo Spinulosus. Eksperyment pokazuje te same odległości migracji w obrębie każdego z trzech podgatunków oraz obecność dwóch pasm w niektórych przebiegach.
wyniki te pokazują, że w 20ºC Bufo spinulosus flavolineatus, którego naturalne środowisko jest bliskie 4000 m i którego średnia temperatura otoczenia wynosi 10ºC, ma niską zawartość hemoglobiny i wysokie powinowactwo do hemoglobiny w porównaniu do Bufo spinulosus trifolium, którego średnia wysokość otoczenia jest bliska 3000 m i którego średnia temperatura otoczenia wynosi 15ºC. Bufo spinulosus limensis (poziom morza) i Bufo spinulosus trifolium miały prawie identyczne krzywe. Jeśli krzywe uzyskano w temperaturach otoczenia, Bufo spinulosus flavolineatus wykazał bardzo niską zawartość O2 i wysokie powinowactwo do hemoglobiny w porównaniu do pozostałych dwóch podgatunków. W Bufo spinulosus flavolineatus wysoki DH ’ wskazuje na wysoką czułość powinowactwa hemoglobiny do zmian temperatury otoczenia, a wysoki czynnik Bohra wskazuje również na wysoką czułość powinowactwa hemoglobiny do zmian pH krwi.
dyskusja
rodzaj Bufo jest rozpowszechniony w krajach Andyjskich. Bufo spinulosus wyróżnia trzy podgatunki, których nisze znajdują się w niższych zboczach Andyjskich, dolinach pośrednich (3000 m) i najwyższych równinach (powyżej 4000 m). Podgatunek Bufo spinulosus trifolium i podgatunek Bufo spinulosus limensis nie różnią się wartościami hematologicznymi. Wysokogórski Bufo spinulosus flavolineatus ma znacznie niższe stężenie hemoglobiny, ale cechy czerwonych krwinek są podobne do pozostałych dwóch podgatunków. RBC wydają się być mniejsze niż u pozostałych dwóch podgatunków, w przeciwieństwie do znalezisk Ruiza (9), które wskazywały na coś przeciwnego. Wiadomo, że rodzaj Bufo ma wyższe stężenie hemoglobiny niż inne płazy. Hutchinson i Szarki (3) przypisują to wysokiemu unaczynieniu i ziemskiemu zwyczajowi. Jednak Bufo spinulosus flavolineatus ma bardzo niskie stężenie hemoglobiny.
w trzech grupach badanie elektroforetyczne hemoglobiny pokazuje osoby, których wzór elektroforetyczny przedstawia dwa wyraźnie oddzielne pasma hemoglobiny. Nie ma różnicy w powinowactwie hemoglobiny pomiędzy Bufo spinulosus trifolium i Bufo spinulosus limensis w temperaturze 20ºC, podczas gdy w Bufo spinulosus flavolineatus jest wyższe. Kiedy pokrewieństwa badano w temperaturach otoczenia, w których żyją zwierzęta, Bufo spinulosus trifolium miał krzywe dysocjacji tlenu, które przesunęły się umiarkowanie w lewo od Bufo spinulosus limensis, a Bufo spinulosus flavolineatus wykazywał bardzo wyraźne przesunięcie, wskazując na bardzo wysokie powinowactwo do hemoglobiny.
rodzime ssaki i ptaki na dużych wysokościach mają tendencję do wysokich powinowactw tlenowych we krwi i nie wykazują policytemii na dużych wysokościach (5). Interesujące byłoby zaobserwowanie, czy te reakcje na niedotlenienie otoczenia i zimne warunki są obecne u zwierząt ektotermicznych. Teoretycznie, zimne warunki powinny przyczynić się do zwiększenia tolerancji na duże wysokości, ponieważ zmniejsza tempo przemiany materii. W przypadku Bufo spinulosus flavolineatus,którego temperatura w ciągu dnia pod skałami na wysokości 4100 m wynosi około 10ºC, a w nocy około 6ºC lub mniej w stawach, w których spoczywają w połowie zanurzone, wysokie powinowactwo wskazuje na presję selekcyjną w kierunku niedotlenienia, pomimo możliwego zmniejszenia tempa metabolizmu. Packard i Stiverson (7) nie znaleźli związku między wysokością a stężeniem hemoglobiny u żaby chóralnej (Pseudacris triseriata), ale zakres wysokości w ich badaniach (1500 m i 3000 m) był niewielki.
powinowactwo do hemoglobiny jest znakiem genetycznym najwyraźniej wybranym przez środowisko niedotlenienia u kręgowców. U ssaków i ptaków powinowactwo jest raczej stałą właściwością, która nie zwiększa się w niedotlenieniu i nie zanika w normoksji (6). Z kolei u ryb tlen we krwi znacznie wzrasta pod wpływem niedotlenienia (13).
z punktu widzenia porównawczego istnieją pewne podobieństwa między ektotermią a endotermią. Stwierdzono, że istnieje pewna korelacja między powinowactwem hemoglobiny a wysokością u podgatunków myszy zajmujących gradient wysokości (11). Wykazano również, że u tych samych gatunków ssaków żyjących wzdłuż pionowego gradientu w Andach, osobniki żyjące w najwyższym zakresie mają hemoglobinę o wyższym powinowactwie niż osobniki żyjące w najniższym zakresie. Różnice te były większe w przypadku LISA andyjskiego, gdzie dwa osobne gatunki zajmują dwie skrajności zakresu wysokości (4).
praca ta wzmacnia koncepcję, że policytemia nie jest wybrana jako parametr adaptacyjny do środowiska niedotlenienia. Przeciwnie, hemoglobina o wysokim powinowactwie wydaje się być silnie wyselekcjonowana u różnych zwierząt żyjących na dużych wysokościach.
podziękowania
dziękujemy Dr. Royowi E. Weberowi za jego pomoc w wyjaśnieniu naszego myślenia na ten temat i za przegląd rękopisu.
Autor Korespondencyjny: Hrvoj Ostojic P.-Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Telefon: (56-57) 420599, Fax: (56-57) 427683, e-mail: [email protected]
otrzymane Dnia: 13.08.1999 r. Przyjęta w zmienionej formie: 6 maja 2000
Bibliografia
1. EDWARDS MJ, MARTIN RJ (1966). Technika mieszania dla równowagi tlen-hemoglobina i efekt Bohra. J Appl Physiol 21:1898-1902
2. HUTCHINSON VH, HAINES HB, ENGEBRETSON G (1976). Aquatic life at high altitude: Respiratory adaptations in the Lake Titicaca frog, Telmatobius culeus. Respir Physiol 2:115-119.
3. HUTCHINSON VH, SZARSKI H (1965) Number of erythrocytes in some amphibians and reptiles. Copeia: 373-375
4. LEON-VELARDE F, DE MUIZON C, PALACIOS JA, CLARK D, MONGE-C C (1996). Hemoglobin affinity and structure in high-altitude and sea-level carnivores from Peru. Comp Biochem Physiol 113a:407-411
5. MCCUTCHEON FH HALL FG (1937) J Cell & Comp Physiol 9:191-197
6. MONGE C, LEON-VELARDE F (1991) Physiological adaptation to high altitude: oxygen transport in mammals and birds. Physiol Rev 71: 1135-1172
7. PACKARD G C STIVERSON RK (1976) stężenie hemoglobiny we krwi u żaby chorusowej (Pseudacris triseriata): stosunek do wielkości ciała i wysokości. Am Midl Nat 96: 482-487
8. ROSENTHAL TB (1948) wpływ temperatury na pH krwi i osocza in vitro. J Biol Chem 173:25-30
9. RUIZ G, ROSENMANN m, VELOSO A. (1989). Altitudinal distribution and blood values in the toad, Bufo spinulosus Wiegmann. Comp Biochem Physiol 94A: 643-646
10. SCHEID P, MEYER m (1978) Mixing technique for study of oxygen-hemoglobina equilibrium: a critical evaluation. J Appl Physiol 45: 818-822
11. SNYDER GK, BLACK CP, BIRCHARD GF (1982) Development and metabolism during hypoxia in embrions of high altitude Anser indicus versus sea level Branta canadensis geese. Physiol Zool 55:113-123
12. VELLARD J (1959) Estudios sobre batracios andinos V: el género Bufo. Mem Hist Nat Javier Prado Nº 8
13. WEBER RE (1992) Molecular strategies in the adaptations of vertebrate hemoglobine function in: WOOD SC, WEBER RE, HARGENS AR, MILLARD RW (eds) Physiol adaptations in vertebrates, New York: Marcel Dekker
14. WINSLOW RM, MORRISSEY JM, BERGER RL, SMITH PD, GIBSON CC (1978) Variability of oxygen affinity of normal blood: an automated method of measurement. J Appl Physiol: Respirat Environ Exercise Physiol 45(2): 289-297