raporty onkologiczne

wprowadzenie

rak płuca jest nowotworem złośliwym o najwyższej chorobowości i śmiertelności na świecie, a jego częstość wzrasta. Około 80% choroby można przypisać tonon-drobnokomórkowy rak płuc (NSCLC) (1). Ze względu na ograniczenia wczesnodiagnostycznych technik i brak wczesnych specyficznych klinicznychmanifestacji, 70-80% pacjentów diagnozuje się w zaawansowanych stadiach(2). W związku z tym, identyfikacja asafe i skuteczne leczenie farmakologiczne NSCLC ma kluczowe znaczenie.

Ostatnie wyniki wykazały,że na częstość występowania, rozwój i przenoszenie NSCLC mają wpływ nie tylko czynniki genetyczne,ale także istotna jest zmiana epigenetyczna, w tym niekodujący RNA małocząsteczkowy (ncRNA) (3). MicroRNA (miRNA) – Klasa endogenousmall ncRNA o długości ~21-25 zasad, powszechnie istniejących w eukaryotes, może zidentyfikować mRNA określonego docelowego genu(4). Ponad 50% genów Mirna jest mapowanych w kruchych miejscach lub regionach genomowych związanych z NSCLC, co sugeruje, że ekspresja miRNA może być ściśle związana z NSCLC. Jak donoszono, ekspresja dużej liczby mirnas inNSCLC wykazuje zaburzenia i brak równowagi miRNAs promują postęp cyklu komórkowego NSCLC, działanie anty-apoptotyczne, zwiększoną inwazję komórek i przerzuty niedrobnokomórkowego raka płuc (5).

szlak sygnałowy PI3K/Akt odgrywa ważną rolę w przeżywaniu komórek za pośrednictwem czynnika wzrostu. Wcześniejsze odkrycie wykazało, że zaburzenie szlaku PI3K/Akt/mTOR może odgrywać ważną rolę w tworzeniu NSCLC (6). Stwierdzono również, że sygnał proliferacji komórek generowany przez połączenie wielu receptorów transmembrany i ligandów może aktywować przekazywanie sygnałów PI3K/Akt/mTOR, co jest ściśle związane z proliferacją NSCLC i statusem przeżycia (7). Receptory te obejmują c-met, receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), c-kit i receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-IR).

kurkumina jest naturalnym składnikiem aktywnym ekstrahowanym z suchego kłącza kurkumy z rodzaju kurkumy, kurkumy i kurkumy, o rozległym działaniu farmakologicznym, niskiej toksyczności i dobrej tolerancji, a ze względu na swoją wartość ekonomiczną stała się hotspotem do eksploracji (8). Wyniki badań koncentrujących się na kurkuminie zidentyfikowały szeroki zakres działań farmakologicznych,takich jak przeciwzapalne, przeciwutleniające, lipidowe, antywirusowe, przeciwzakrzepowe,przeciwnowotworowe, przeciwzakrzepowe, przeciw zwłóknieniu wątroby i miażdżycy, niskotoksyczność i kilka skutków ubocznych (9-13).Jednak wpływ kurkuminy na niedrobnokomórkowy niedrobnokomórkowy i podkładmechanizm cząsteczkowy pozostaje niejasny. W niniejszym badaniu zbadaliśmy przeciwnowotworowe działanie kurkuminy na proliferację komórek i apoptozę ludzkiego NSCLC i zidentyfikowaliśmy możliwy związek między tym działaniem a modulowanym przez miRNA-192-5p szlakiem PI3K/Aktsignaling.

materiały i metody

chemikalia

zmodyfikowany środek Eagle ’ s Dulbecco (dmem) i serum fetalcalf (FBS) zostały zakupione od Gibco (Carlsbad, CA, USA) i(Ameryka Południowa). Bromek 3-(4,5-dimetylo-tylotiazol-2-ilo)-2,5 difenylotetrazolu(MTT) został zakupiony od Sangon Biotech (Szanghaj, Chiny). Zestaw do wykrywania apoptozy i został zakupiony z Biosciences (San Jose, CA, USA). Caspase-3 activity assaykit został zakupiony w firmie Promega (Madison, WI, USA).

kultura komórkowa

Ludzkie normalne komórki nabłonkowe płuc NCL-H460 i BEAS-2E oraz ludzkie komórki raka płuc a549 uzyskano z Centrum CellResource drugiego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego. Komórki te hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS (oba fromGibco), 100 U/ml penicyliny i 100 µg / ml streptomycyny w temperaturze 37°C oraz inkubatorze nawilżającym z 5% CO2. Badano koncentracje (5,10,20 i 40 µM) i okresy czasu (12 i 24 h) kurkuminy wobec komórek A549. Chemicznastruktura kurkuminy pokazano na Fig.1.

analiza żywotności komórek

komórki wysiewano z gęstością 5×103/studzienkę w płytkach 96-studzienkowych. W skrócie, aktywność komórek była mierzona za pomocą testu MTT (Sangon Biotech). Do każdej studzienki dodano dziesięć mikrolitrów MTT (5 mg/l) i inkubowano przez 4 godziny w 37°C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2. Sulfotlenek dimetylu(150 µl; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) dodawano do każdej studni i mieszano przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Absorbancję mierzono przy 450 nM za pomocą czytnika amikroplanów.

analiza apoptozy Aneksyny V-FITC/jodku propidium (PI)

komórki wysiewano z gęstością 1×106/studzienki w płytkach 6-studzienkowych. Hodowane komórki płukano lodowatym PBS, a następnie barwiono aneksem V-FITC i stosując zestaw do wykrywania apoptozy I zgodnie z instrukcjami producenta (BD Biosciences). Apoptozę analizowano metodą flowcytometryczną przy użyciu oprogramowania CellQuest Pro (IVD) (oba z BDBiosciences).

analiza aktywacji kaspazy-3

komórki wysiewano z gęstością 5×103/studzienkę w płytkach 96-studzienkowych. Aktywność kaspazy-3 mierzono za pomocą zestawu do oznaczania aktywności kaspazy-3 zgodnie z instrukcjami producenta (Promega). Do 10 µl lizatu proteincellu/studzienki dodano sto mikrolitrów buforu reakcyjnego z 10 µl substratu Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-P-nitroaniliny (pna) i inkubowano w 37°C przez 6 godzin. aktywność kaspazy-3 analizowano przy absorbancji 405 nm.

transfekcja komórek

Mir-192-5p, anty-miR-192-5p i negatywna Kontrola (miR-NC) zostały zakupione od Sangon Biotech. Komórki wysiewano w 6-studzienkowych płytkach i urosły do 50-60% . Mimiki transfekowano za pomocą Lipofektaminy2000 do komórek zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen Life Technologies). Gen lub białko wyizolowano 24 hafter transfekcji i wykorzystywane do odwrotnej transkrypcji-quantitativepolymerase reakcji łańcuchowej (RT-qPCR) lub Western blot analizy,odpowiednio.

RT-qPCR

komórki wysiewano z gęstością 5×103/studzienkę w płytkach 96-studzienkowych. Całkowity RNA wyekstrahowano z komórek przy użyciu odczynnika Trizolowego (Invitrogen Life Technologies).Stężenie RNA oznaczono za pomocą spektrofotometru NanoDrop®ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, USA). Oznaczanie ilościowe Mirna przeprowadzono za pomocą zestawu TaqMan miRNA assay kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Całkowity RNA poddano syntezie cDNA pierwszej nici i poddano analizie przy użyciu zestawu odczynników PrimeScript RT (oba z Takara,Shiga, Japonia). qPCR wykonano przy użyciu SYBR-Green PCR Master Mix(Takara) na systemie ABI 7500HT. Zastosowane tam startery przedstawiono w tabeli I.

Tabela i zastosowane tam podkłady PCR.

Analiza Western blot

komórki wysiewano z gęstością 5×103 / studzienkę w płytkach 96-studzienkowych. Hodowane komórki płukano lodowatym PBS i inkubowano z lodowatym buforem lizy przez 30 minut na lodzie. Ciecz komórkową zebrano i odwirowano w temperaturze 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Stężenie rozpuszczalnego białka określono za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA (Sigma, St.Louis, MO,USA). Białka całkowite (10 µg) przepuszczano na 12% żelach poliakryloamidowych dodecylosiarczanu sodu (SDS) i przenoszono do membran polifluorku winylidenu (PVDF). Błony były blokowane za pomocą buforowanej roztworem soli fizjologicznej (TBS) zawierającej 5% mleka beztłuszczowego w celu zablokowania miejsc wiązania specyficznych dla danego produktu. Membrany zostały inkubowane z anty-PI3K (1:1500) i anty-Akt (1:1000) (oba z Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) i anty-β-aktyna (1:500;Sangon Biotech) w nocy w temperaturze 4°C. Po przemyciu 1% Tween-20/PBS, membrany inkubowano z drugimi przeciwciałami (Tiangen, Pekin, Chiny) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.Białka wykryto przy użyciu wzmocnionej chemiluminescencji (Vilber, Marne La Vallée, Francja).

analiza statystyczna

analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS 19.0. Wyniki przedstawiono jako średnią ± SD. Wyniki analizowano za pomocą testu t Studenta lub jednokierunkowej analizy wariancji(ANOVA). P<0, 05 uznano za statystycznie istotne.

wyniki

kurkumina hamuje żywotność komórek A549

stężenia (5, 10, 20 i 40 µM) i Okresy czasowe (12, 24 lub 36 h) kurkuminy wobec komórek a549 oceniano za pomocą testu MTT. Fig.2 pokazuje, że leczenie komórek A549 przez 12, 24 lub 48 godzin kurkuminą o wielkości 10, 20 i 40 µM hamowało żywotność komórek w sposób zależny od czasu i czasu. Test MTT wykazał, że leczenie kurkuminą (20 i 40 µM) przez 24 lub 36 godzin spowodowało nieznaczną żywotność komórek w porównaniu z grupą kontrolną(Fig. 2).

kurkumina indukuje apoptozę komórek A549

przed rozpoczęciem leczenia mierzono również szybkość apoptotyczną komórek a549 poddanych działaniu kurkuminy (10, 20 lub 40 µM). Po leczeniu kurkuminą 20 lub 40 µM przez 24 godziny, szybkość apoptotyczna znacznie wzrosła w zależności od dawki, w porównaniu z grupą kontrolną (Fig. 3).

kurkumina indukuje aktywność kaspazy-3 w komórkach a549

aby określić, czy kurkumina indukuje aktywność kaspazy-3 w komórkach a549, aktywność kaspazy-3 mierzono za pomocą zestawu do oznaczania aktywności acaspazy-3. Aktywność kaspazy-3 również znacznie wzrosła w sposób zależny od dawki po leczeniu kurkuminą (20 lub 40µm) przez 24 godziny, w porównaniu z grupą kontrolną(Fig. 4). Wyniki te wskazywały, że kurkumina wywołała apoptozę w komórkach A549.

miR-192-5p hamuje żywotność komórek i zmniejsza apoptozę komórek A549

aby zbadać ekspresję i znaczenie mir-192-5P w normalnych ludzkich komórkach nabłonka płuc i raka płuc,względną ekspresję mir-192-5p wykryto przy użyciu RT-qPCR.Fig. 5A pokazuje, że ekspresja mir-192-5prelacyjna komórek NCL-H460 była stosunkowo niższa, komórki ofA549 były wyższe, przy czym komórki BEAS-2e były najbardziej wyekspresowane.

aby przeanalizować, czy miR-192-5p wpłynął na zdolność komórkową i apoptozę komórek A549, przetoczyliśmy mir-192-5pmimics do komórek a549. Komórki transfekowane mir-192-5pmimics wykazały znaczący, 120-krotny wzrost ekspresji miR-192-5 po 48 h transfekcji, w porównaniu z grupą kontrolną ormiR-NC (Fig. 5b).Nadekspresja mir-192-5p zmniejszyła żywotność komórek A549 w porównaniu z grupą kontrolną lub grupą mir-NC (Fig. 5C). Jednak nadekspresja mir-192-5p wywołała szybkość apoptotyczną komórek A549, w porównaniu z grupą kontrolną lub grupą mir-NC (Fig.5D).

hamowanie miR-192-5p hamuje zdolność komórkową i indukuje apoptozę komórek a549

aby ustalić, czy anty-miR-192-5p wpłynął na żywotność komórek i apoptozę komórek a549, przetransfekowaliśmy naśladownictwo anty-miR-192-5p do komórek a549. Poziom ekspresji mir-192-5P wykryto za pomocą RT-qPCR po transfekcji 48 h.Mimika anty-miR-192-5p skutecznie tłumiła ekspresję mir-192-5prelacyjną komórek a549 (Fig.6a). Zmniejszona Regulacja mir-192-5p promowała żywotność komórek i hamowała szybkość apoptotyczną komórek A549, odpowiednio, w porównaniu z grupą kontrolną lub grupą mir-NC (Fig.6B i C).

kurkumina hamuje ekspresję genu Mir-192-5p komórek A549

w celu określenia, czy kurkumina wpłynęła na ekspresję miR-192-5pgen komórek a549, poziom ekspresji miR-192-5p wykryto za pomocą RT-qPCR po leczeniu kurkuminą przez 24 godziny. Fig. 7 pokazuje, że poziom ekspresji miR-192-5p został znacznie wzmocniony przez kurkuminę (20 lub 40µM).

miR-192-5p hamuje wpływ kurkuminy na żywotność komórek i indukuje apoptozę komórek a549

aby zbadać, w jaki sposób nadmierna ekspresja miR-192-5p wpłynęła na wpływ kurkuminy na żywotność komórek i szybkość apoptotyczną komórek a549, transfekowaliśmy mir-192-5P naśladuje komórki aa549. Fig. 8 pokazuje, że kurkumina hamowała żywotność komórek i zwiększała wskaźnik apoptotyczny komórek A549 po leczeniu kurkuminą (20 µM) odpowiednio przez 24 godziny w porównaniu z grupą kontrolną. Wpływ kurkuminy(20 µM) na żywotność komórek i szybkość apoptotyczną komórek a549 był znacznie zmniejszony i zwiększony odpowiednio przez mir-192-5pmimics w porównaniu z grupą leczoną kurkuminą (Fig. 8a).

hamowanie mir-192-5p hamuje wpływ kurkuminy na żywotność komórek i indukuje apoptozę komórek A549

aby zbadać, w jaki sposób obniżenie regulacji miR-192-5p wpłynęło na wpływ kurkuminy na żywotność komórek i szybkość apoptotyczną komórek a549, transfekowaliśmy anty-miR-192-5P naśladując komórki a549. Fig. 9 pokazuje, że kurkumina hamowała żywotność komórek i zwiększała wskaźnik apoptotyczny komórek A549 po leczeniu kurkuminą (20 µM) odpowiednio przez 24 godziny w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak wpływ kurkuminy (20 µM) na żywotność komórek i szybkość apoptotyczną komórek A549 był znacznie zwiększony i zmniejszony odpowiednio przez naśladownictwo Anti-miR-192-5P w porównaniu z grupą leczoną kurkuminą (Fig.9a).

kurkumina hamuje ekspresję białka PI3K/Akt komórek a549

w celu wykrycia, czy kurkumina wpływa na ekspresję PI3K/Aktprotein komórek a549, ekspresję białka PI3K/Akt wykryto za pomocą analizy western blot po leczeniu kurkuminą przez 24 godziny. Fig. 10 pokazuje, że ekspresja białka PI3K/Akt została znacznie zwiększona przez kurkuminę (20 lub 40 µM).

miR-192-5p bezpośrednio celuje w komórki PI3K/Akt ofA549

aby zbadać, w jaki sposób nadekspresja miR-192-5p wpłynęła na ekspresję białka PI3K/Akt w komórkach a549, wetransfektowane mir-192-5p naśladuje komórki A549. Fig. 11A i B pokazują, że kurkumina poddała ekspresji białka PI3K/Akt komórek a549 po leczeniu kurkuminą (20 µM) przez 24 godziny, w porównaniu z grupą kontrolną. Wpływ kurkuminy (20 µM) na ekspresję białka PI3K/Akt w komórkach a549 był wyraźnie zmniejszony przez Mimir-192-5P, w porównaniu z grupą leczoną kurkuminą(Fig. 11C i D).

hamowanie miR-192-5p zwiększa ekspresję PI3K/Akt komórek a549

w celu określenia, czy anty-miR-192-5p wpłynęło na efekt kurkuminy na ekspresję białka PI3K/Akt komórek a549, wetransfektowane anty-miR-192-5P naśladuje komórki a549. Fig. 12A i B pokazują, że kurkumina poddała ekspresję białka PI3K/Akt komórek a549 po leczeniu kurkuminą (20 µM) odpowiednio przez 24 godziny w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak wpływ kurkuminy (20 µM) na ekspresję białka PI3K/Akt w komórkach a549 został znacznie wzmocniony odpowiednio przez mimiki anty-miR-192-5P w porównaniu z grupą leczoną kurkuminą (Fig.12C i D).

dyskusja

milion pacjentów rocznie ulega NSCLC, a częstość występowania NSCLC stopniowo wzrasta.Chociaż szereg badań w ostatnich latach koncentrowały się na NSCLC, nie poczyniono wielkich postępów w odniesieniu do leczenia. Chirurgia utrzymuje najskuteczniejszą metodę leczenia, ale pod względem prewencji, a także patogenezy NSCLC należy przeprowadzić dalsze badania (14,15). Niedawno Liu i wsp. zidentyfikowali, że kurkumina hamuje proliferację i znacznie indukuje szybkość apoptotyczną komórek raka żołądka (16). Ma i wsp. wykazali, żekurkumina hamuje wzrost komórek i inwazję komórek raka trzustki (17). Łącznie nasze ustalenia wykazały, że kurkumina hamowała żywotność komórek, indukowała apoptozę komórek i zwiększała aktywność kaspazy-3 komórek A549.Dlatego kurkumina jest potencjalnym lekiem do onkoterapii.

miRNA jest klasą małocząsteczkowego RNA, która pełni bardzo ważną rolę w regulacji ekspresji genów, jak niedawno zidentyfikowano (18). geny miRNA zlokalizowane są w intronowych segmentach genu. Jednakże Mirna są również dystrybuowane poza niekodującymi eksonami genu i regionu intergenicznego, które okazały się uczestniczyć w wielu znanych szlakach ogenicznych onc, takich jak p53, Bcl-2 i K-Ras(19). Wykazano,że >50% zdefiniowanych ludzkich Mirna znajduje się w kruchych miejscach genomu i te kruche miejsca są często związane z występowaniem NSCLC (20). Profile ekspresji Mirna są związane z rozwojem NSCLC. miR-34C, miR-145 i miR-142 mogą hamować NSCLC (5). Wyniki niniejszego badania wskazują, że mir-192-5P względna ekspresja komórek NCL-H460 była stosunkowo niska, a komórki A549 wyższa, przy czym komórki BEAS-2e były najbardziej ekspresyjne. Nadekspresja miR-192-5p zmniejszyła żywotność komórek i zwiększyła szybkość apoptotyczną komórek a549. Obniżenie poziomu miR-192-5p zwiększyło zdolność komórkową i zmniejszyło szybkość apoptotyczną komórek A549.Dodatkowo kurkumina hamowała ekspresję genu Mir-192-5p komórek A549. Jednak wzrost regulacji ekspresji miR-192-5p poprawił wpływ kurkuminy na żywotność komórek i szybkość apoptotyczną komórek a549, podczas gdy obniżenie regulacji ekspresji miR-192-5p spowodowało wpływ kurkuminy na komórki a549. Nasze wyniki były zgodne z wynikami innych badań. Na przykład ye etal poinformował, że kurkumina Promuje apoptozę komórkową poprzez aktywację 192-5p (21). Jednakże możliwe mechanizmy wpływania kurkuminy na ekspresję miR-192-5 są niejasne i należy przeprowadzić przyszłe badania w celu określenia tego efektu.

W ostatnich latach wpływ szlaku PI3K/Aktsignaling na ludzki NSCLC zyskał wiele uwagi(22). Aktywacja szlaku PI3K / Aktsignaling jest bardzo powszechna w ludzkim NSCLC, który może promować występowanie raka poprzez różne mechanizmy, w tym mutacje genowe, redukcję Ptenekspresji genu supresorowego raka, mutację lub amplifikację PI3K, mutację lub amplifikację Akt i aktywację receptora onkogenowego (7). Aktywacja każdego składnika tej drogi jest główną przyczyną niekorzystnego rokowania NSCLC, co może prowadzić do lekooporności leczenia, a zatem hamowanie tego szlaku może odwrócić lekooporność i poprawić efekty hemoterapii i promieniowania in vivo (23). Dane uzyskane w obecnym badaniu wykazały, że kurkumina hamowała ekspresję białka PI3K/Akt komórek a549. Zwiększenie ekspresji miR-192-5p spowodowało ekspresję białka PI3K/Akt w komórkach a549.Obniżenie ekspresji miR-192-5p może zwiększyć ekspresję PI3K/Aktprotein komórek a549. Xu i wsp. wykazali, że kurkumina hamuje inwazję i migrację komórek ftc133 zmniejszającą regulację szlaku sygnałowego PI3K/Akt w komórkach raka tarczycy (24). Xu et alsuggested that curcumin hamuje proliferację nowotworu płuc poprzez szlak PI3K/Akt (25).Schee i wsp.ujawnili, że mir-22-3P, miR-143-3P Imir-192-5p regulowały i brały udział w APC, TGFß i PI3Kpathway w komórkach raka jelita grubego (26).

podsumowując, badanie to koncentrowało się na wpływie kurkuminy na komórki a549, hamowało proliferację komórek i zmniejszało apoptozę ludzkiego NSCLC poprzez podwyższenie regulacjimir-192-5p i tłumienie szlaku sygnałowego PI3K/Akt. Wnioski z niniejszego badania wskazują, że kurkumina jest apotentialnym celem w leczeniu NSCLC. Jednak obecne badanie ujawniło pewne ograniczenia, ponieważ nie zbadaliśmy szczegółowej zależności między miR-192-5p a szlakiem PI3K/Akt w komórkach raka płuca. Aby zweryfikować wyniki, należy przeprowadzić dodatkowe badania in vivo, kliniczne i większe analizy statystyczne niniejszego badania.