PMC

Pseudomonas aeruginosa este o bacterie gram-negativă de mediu omniprezentă Găsită în sol și apă. Este, de asemenea, un agent patogen oportunist care provoacă infecții la persoanele cu defecte imune înnăscute, inclusiv la pacienții cu fibroză chistică (CF) (8). P. aeruginosa întâlnește medii cu conținut scăzut de oxigen în sol și apă. Dovezile indică faptul că la oamenii cu FC, bacteriile pot fi, cel puțin parțial, într-un mediu cu conținut scăzut de oxigen în masele mucopurulente sau biofilmele din tractul respirator (19). P. aeruginosa este capabilă să crească anaerob în prezența acceptorilor de electroni terminali, cum ar fi nitratul (NO3−), nitritul (NO2−) și oxidul de azot (N2O) sau când l-arginina este un substrat pentru creștere (21). Mucusul căilor respiratorii CF este suficient de bogat în NO3− și NO2− pentru a susține creșterea anaerobă a P. aeruginosa (7, 19). În acest studiu, a fost efectuată o comparație a proteomului P. aeruginosa în timpul creșterii în prezența și absența oxigenului.

P. tulpina aeruginosa PAO1 obținută de la Steve Lory (Harvard Medical School, Boston, MA) a fost cultivată în flacoane de 125 ml în bulion de Luria (LB) suplimentat cu 1% KNO3 cu agitare la 200 rpm la 37 CTC pentru creșterea aerobă. Creșterea anaerobă a fost finalizată așa cum s-a descris anterior (9) în 80 ml de mediu în sticle de ser Wheaton de 100 ml (Fisher Scientific) cu dopuri de cauciuc. Mediul a fost lipsit de oxigen prin supunerea la barbotare cu gaz N2 timp de 1 oră. Atât pentru condițiile aerobe, cât și pentru cele anaerobe, bacteriile au fost recoltate în faza logaritmică târzie a creșterii, moment în care densitatea celulară (densitatea optică la 600 nm) a culturii anaerobe a fost de 44% din densitatea culturii aerobe. Nu a existat nicio diferență semnificativă între pH-urile culturilor recoltate (pH 7,6 pentru cultura anaerobă și pH 7,4 pentru cultura aerobă). Cantități egale de proteine denaturate și reduse de celule întregi (2.0 mg din fiecare stare de creștere) au fost etichetate fie cu reactiv ușor (12c), fie cu reactiv greu (13C) scindabil cu etichetă de afinitate codificată cu izotopi (ICA) (Applied Biosystems, Foster City, CA), prelucrate și analizate așa cum s-a descris anterior (3). Datele raportate sunt mediile a cel puțin două experimente independente.

șase sute zece proteine P. aeruginosa au fost identificate și cuantificate folosind ICA (pentru o listă completă de proteine, vezi Tabelul S1 din materialul suplimentar). Dintre cele 151 de proteine ale căror abundențe s-au schimbat în timpul creșterii anaerobe, 76 au fost mai mari în abundență (tabelul (tabelul 1)1) și 75 au fost mai mici în abundență (Tabelul 2).2). După cum era de așteptat, 13 proteine care participă la creșterea și denitrificarea anaerobă (inclusiv produsele genelor nir, nos și nar) au fost exprimate la niveluri mai ridicate în timpul creșterii anaerobe (tabelul (tabelul 1).1). Aceste rezultate sugerează că modificările observate în conținutul de proteine includ cele care rezultă în mod specific din creșterea la diferite niveluri de oxigen.

modificările proteomului detectat ar putea reflecta, de asemenea, diferențe în toate reglările dependente de densitate, pe lângă efectele tensiunii oxigenului, având în vedere densitatea celulară relativă mai mică a culturii anaerobe recoltate. Într-adevăr, 29 de proteine detectate în abundență mai mică în celulele crescute anaerob sunt codificate de gene care s-au dovedit anterior a fi induse de detectarea cvorumului (5, 16, 17). Acestea includ subunitățile de cianură de hidrogen sintază HcnB și HcnC; Pseudomonas chinolonă semnal enzime biosintetice PqsB, PqsC, și PqsD; și PhnB (tabel (Table2).2). În concordanță cu rezultatele noastre, genele hcn și pqs s-au dovedit, de asemenea, reprimate transcripțional în timpul creșterii anaerobe printr-o analiză recentă a microarray-ului ADN utilizând culturi aerobe și anaerobe recoltate la aceeași densitate celulară (1) (tabelul (tabelul 22).

pentru a identifica p secretat. proteinele aeruginosa cu niveluri modificate în timpul creșterii anaerobe, proteinele supernatante de cultură au fost concentrate (11) și separate prin electroforeză în gel dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) (Fig. (Fig.1).1). Patru benzi proteice colorate cu Coomassie, corespunzătoare proteinelor exprimate diferențiat, au fost identificate și analizate ca într-un studiu anterior (4) (Fig. (Fig.1).1). Abundența a trei proteine secretate părea să scadă în timpul creșterii anaerobe: proteina care leagă chitina CbpD, elastaza LasB și o proteină cu funcție necunoscută codificată de PA0572. Studiile proteomice anterioare au constatat că toate aceste trei proteine sunt induse de detectarea cvorumului (11). O proteină părea să fie crescută din abundență în timpul creșterii anaerobe și a fost identificată fie ca proteina Flic a filamentului flagelar, fie ca proteina Flid de acoperire flagelară (datorită suprapunerii caracteristicilor acestor două proteine).

majoritatea proteinelor membranei exterioare P. aeruginosa nu conțin reziduuri de cisteină și, prin urmare, nu pot fi analizate de ICA (4). Prin urmare, pagina bidimensională (2D) a fost utilizată ca metodă complementară (4). Mai multe proteine de membrană exterioară (Fig. (Fig.2) 2) au fost excizate din gelul 2D și identificate (4). OprE părea să crească din abundență în timpul creșterii anaerobe, în timp ce OprF și OprH păreau să scadă din abundență (Fig. (Fig.2).2). Toate cele trei proteine au migrat ca specii multiple în timpul focalizării izoelectrice (Fig. (Fig.2).2). Scăderea abundenței OprF în timpul creșterii anaerobe a fost confirmată prin imunoblotarea proteinelor membranei exterioare (datele nu sunt prezentate), folosind un antiser policlonal anti-OprF (un cadou de la Robert Hancock, Universitatea British Columbia din Vancouver, Canada).

printre proteinele P. aeruginosa care au prezentat abundență crescută în timpul creșterii anaerobe (tabel (Tabel1;1; Fig. Fig.1), 1), mai multe contribuie la funcțiile implicate în formarea și dezvoltarea biofilmelor. Aceste proteine includ proteina Crc de control al represiunii catabolite și proteinele de motilitate convulsivă PilU, PilG și ChpA (12, 13, 18). În concordanță cu un nivel crescut de Crc în celulele crescute anaerob [tabelul (tabelul 1),1], țintele cunoscute ale represiunii Crc au scăzut din abundență [tabelul (tabelul 2), 2), inclusiv produsele genei hmgA și bkd (6, 10). ChpA și PilG sunt componente ale unui sistem complex de reglementare care controlează motilitatea răsucirii (18). Luate împreună, aceste rezultate sugerează că expresia sau funcția apendicelor suprafeței celulare care afectează formarea biofilmului este modificată în timpul creșterii anaerobe. Astfel de modificări pot contribui la formarea crescută a biofilmului observată la creșterea anaerobă a P. aeruginosa (20).

în plus față de modificările proteinelor membranei exterioare observate în timpul creșterii anaerobe, analiza ICA a arătat că mai multe enzime implicate în biosinteza lipopolizaharidei P. aeruginosa (LPS) au fost exprimate la niveluri mai ridicate în timpul creșterii anaerobe (tabelul (tabelul 1).1). Acestea au inclus un omolog al beta-hidroxilazei lpxo2, care hidroxilează acizii grași lipidici A (14); heptosiltransferazele de bază LPS WaaC și WaaF (2, 15); și WbpG, care este codificat de un grup de gene care participă la sinteza unui antigen o cu bandă lungă B. Aceste rezultate sugerează că conținutul de LPS ar putea fi modificat ca o consecință a anaerobiozei.

în rezumat, proteomul P. aeruginosa se modifică semnificativ în timpul creșterii anaerobe. Am identificat 617 proteine în total: 610 prin analiza ICA, 4 prin analiza SDS-PAGE și 3 prin analiza paginii 2D. Dintre cele 617 proteine identificate, abundențele a 158 au variat între celulele crescute anaerob și cele crescute aerob. Deoarece P. aeruginosa a atins o densitate celulară mai mică în condițiile noastre de creștere anaerobă decât în condițiile de creștere aerobă, modificările dependente de densitate în expresia proteinelor ar fi putut contribui la proteomul pe care l-am detectat în timpul creșterii anaerobe. Cu toate acestea, densitatea celulelor bacteriene este probabil să fie limitată în mod similar în multe nișe de mediu în care mai mulți nutrienți (inclusiv oxigenul) sunt puțini. Prin urmare, modificările nivelurilor de proteine pe care le-am detectat contribuie la înțelegerea modului în care proteomul și starea metabolică a bacteriilor variază ca răspuns la diferite medii. Analiza directă a conținutului de proteine bacteriene este o tehnologie robustă pentru a observa adaptarea bacteriilor la nișe specifice de mediu, inclusiv căile respiratorii CF.