PMC

Pseudomonas aeruginosa on kaikkialla esiintyvä ympäristögramnegatiivinen bakteeri, jota esiintyy maaperässä ja vedessä. Se on myös opportunistinen patogeeni, joka aiheuttaa infektioita henkilöille, joilla on synnynnäisiä immuunivaurioita, mukaan lukien kystinen fibroosi (CF) – potilaat (8). P. aeruginosa kohtaa vähähappisia ympäristöjä maaperässä ja vedessä. Todisteet osoittavat, että ihmisillä, joilla on CF, bakteerit voivat ainakin osittain olla vähähappisessa ympäristössä mukopurulenttisissa massoissa tai biofilmeissä hengityselimissä (19). P. aeruginosa pystyy kasvamaan anaerobisesti terminaalisten elektronien, kuten nitraatin (NO3−), nitriitin (NO2−) ja typpioksidin (N2O) läsnä ollessa tai L-arginiinin ollessa kasvualustana (21). CF-hengitysteiden limassa on riittävästi NO3− ja NO2− yhdisteitä tukemaan P. aeruginosan (7, 19) anaerobista kasvua. Tässä tutkimuksessa vertailtiin P. aeruginosa-proteomia kasvun aikana hapen läsnä ollessa ja ilman.

P. Steve Loryltä (Harvard Medical School, Boston, MA) saatu aeruginosa-kanta PAO1 kasvatettiin 125 ml: n pulloissa Luria-liemessä (lb) täydennettynä 1% KNO3: lla ja ravistamalla 200 rpm: ssä 37°C: ssa aerobista kasvua varten. Anaerobinen kasvu saatiin päätökseen edellä kuvatulla tavalla (9) 80 ml: ssa elatusainetta 100 ml: n Wheaton serum-pulloissa (Fisher Scientific), joissa oli kumitulpat. Väliaine menetti hapen, kun se joutui kuplimaan N2-kaasun kanssa 1 tunnin ajan. Sekä aerobisissa että anaerobisissa olosuhteissa kerättiin bakteereja myöhäisessä logaritmisessa kasvuvaiheessa, jolloin anaerobisen viljelmän solutiheys (optinen tiheys 600 nm: ssä) oli 44% aerobisen viljelmän tiheydestä. Korjattujen viljelmien pHs: n välillä ei ollut merkittävää eroa (anaerobisen viljelmän pH 7,6 ja aerobisen viljelmän pH 7,4). Yhtä paljon denaturoitua ja pelkistettyä kokosoluproteiinia (2.0 mg kustakin kasvutilasta) merkittiin joko kevyellä (12c) tai raskaalla (13c) isotooppikoodatulla affinity tag (ICAT)-reagenssilla (Applied Biosystems, Foster City, CA), käsiteltiin ja analysoitiin edellä kuvatulla tavalla (3). Raportoidut tiedot ovat vähintään kahden riippumattoman kokeen keskiarvoja.

Kuusisataatakymmentä P. aeruginosa-proteiinia tunnistettiin ja kvantifioitiin ICAT: n avulla (täydellinen proteiiniluettelo, KS.täydentävän aineiston taulukko S1). Niistä 151 proteiinista, joiden pitoisuudet muuttuivat anaerobisen kasvun aikana, 76: n pitoisuus oli suurempi (taulukko (Taulukko1)1) ja 75: n pitoisuus pienempi (taulukko (Taulukko2).2). Odotetusti 13 anaerobiseen kasvuun ja denitrifikaatioon osallistuvaa proteiinia (mukaan lukien Nir -, nos-ja nar-geenien tuotteet) ilmaistiin korkeammilla tasoilla anaerobisen kasvun aikana (Taulukko 1).1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että havaitut muutokset proteiinipitoisuudessa sisältävät ne muutokset, jotka johtuvat nimenomaan kasvusta eri happitasoilla.

havaitun proteomin muutokset voivat ilmentää happijännityksen vaikutusten lisäksi eroja kaikessa tiheydestä riippuvaisessa säätelyssä, kun otetaan huomioon anaerobisen viljelmän pienempi suhteellinen solutiheys. Anaerobisesti kasvatetuissa soluissa 29 proteiinia, joita on havaittu vähemmän runsaasti, on aiemmin quorum sensing-indusoitujen geenien koodaamia (5, 16, 17). Näitä ovat Vetysyanidisyntaasin alayksiköt HcnB ja HcnC; Pseudomonas kinoloni signaali biosynteettiset entsyymit PqsB, PqsC, ja Pqsd; ja PhnB (taulukko (Taulukko2).2). Tulosten mukaisesti hcn-ja pqs-geenit havaittiin myös transkriptioiden tukahduttamiksi anaerobisen kasvun aikana tuoreessa DNA-mikroarray-analyysissä, jossa käytettiin samalla solutiheydellä korjattuja aerobisia ja anaerobisia viljelmiä (1) (taulukko 22).

erittyneen P. aeruginosa-proteiinit, joiden pitoisuus muuttui anaerobisen kasvun aikana, supernatanttiproteiinit konsentroitiin (11) ja erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesillä (SDS-PAGE) (Kuva. (Kuva.1).1). Neljä Coomassie-värjättyä proteiininauhaa, jotka vastaavat eri tavoin ilmaistuja proteiineja, tunnistettiin ja analysoitiin kuten aiemmassa tutkimuksessa (4) (Kuva. (Kuva.1).1). Kolmen eritetyn proteiinin pitoisuudet näyttivät vähenevän anaerobisen kasvun aikana: CbpD kitiiniä sitovan proteiinin, LasB-elastaasin ja pa0572: n koodaaman tuntemattoman proteiinin. Aiemmissa proteomisissa tutkimuksissa havaittiin, että kaikki kolme näistä proteiineista ovat quorum sensing indusoituja (11). Yksi proteiini näytti lisääntyvän runsaasti anaerobisen kasvun aikana, ja se tunnistettiin joko flagellaarifilamenttiproteiini Fliciksi tai flagellaarikapseliproteiini Flidiksi (näiden kahden proteiinin ominaisuuksien päällekkäisyyden vuoksi).

useimmat P. aeruginosa-ulomman kalvon proteiinit eivät sisällä kysteiinijäämiä, joten niitä ei voida analysoida ICAT: llä (4). Tämän vuoksi käytettiin kaksiulotteista (2D) sivua täydentävänä menetelmänä (4). Useat ulommat kalvoproteiinit (Kuva. (Kuva.2) 2) poistettiin 2D-geelistä ja tunnistettiin (4). Opre näytti lisääntyvän runsaasti anaerobisen kasvun aikana, kun taas OprF ja OprH näyttivät vähenevän runsaudessa (Kuva. (Kuva.2).2). Kaikki kolme proteiinia vaelsivat useina lajeina isoelektrisen fokusoinnin aikana (Kuva. (Kuva.2).2). Oprf: n väheneminen anaerobisen kasvun aikana varmistettiin immunoblottaamalla uloimpia kalvoproteiineja polyklonaalisella anti-OprF-antiseerumilla (lahja Robert Hancockilta, University of British Columbia, Vancouver, Kanada).

niistä P. aeruginosa proteiineja, jotka osoittivat runsautta anaerobisen kasvun aikana (taulukko (Taulukko1;1; kuva. Kuva.1), 1), useat edistävät biofilmien muodostumiseen ja kehittämiseen liittyviä toimintoja. Näitä proteiineja ovat muun muassa kataboliitti-torjuntaproteiini Crc sekä nykivää motiliteettiproteiinia PilU, PilG ja ChpA (12, 13, 18). CRC: n lisääntynyt taso anaerobisesti kasvatetuissa soluissa (taulukko (Taulukko1),1) johti siihen, että Crc: n torjunnan tunnetut kohteet vähenivät runsaasti (taulukko (Taulukko2),2), mukaan lukien hmga-ja bkd-geenituotteet (6, 10). ChpA ja PilG ovat osia monimutkaisesta säätelyjärjestelmästä, joka säätelee nykivää liikkuvuutta (18). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että biofilmin muodostumiseen vaikuttavien solupinnan lisäkkeiden ilmentyminen tai toiminta muuttuu anaerobisen kasvun aikana. Tällaiset muutokset voivat osaltaan lisätä P. aeruginosan anaerobisesti kasvavien biofilmien muodostumista (20).

anaerobisen kasvun aikana havaittujen ulompien kalvoproteiinien muutosten lisäksi ICAT-analyysi osoitti, että useita P. aeruginosa-lipopolysakkaridin (LPS) biosynteesiin osallistuvia entsyymejä ilmeni korkeammilla pitoisuuksilla anaerobisen kasvun aikana (Taulukko 1).1). Näitä olivat beetahydroksylaasi LpxO2, joka hydroksyloi lipidi a-rasvahappoja (14), LPS-ytimen heptosyylitransferaasit WaaC ja WaaF (2, 15) ja WbpG, jota koodaa pitkän B-kaistan O-antigeenin synteesiin osallistuva geeniklusteri. Tulokset viittaavat siihen, että LPS-pitoisuus saattaa muuttua anaerobioosin seurauksena.

yhteenvetona voidaan todeta, että P. aeruginosa-proteomi muuttuu merkittävästi anaerobisen kasvun aikana. Tunnistimme yhteensä 617 proteiinia: 610 ICAT-analyysillä, 4 SDS-SIVUANALYYSILLÄ ja 3 2D-SIVUANALYYSILLÄ. 617 tunnistetusta proteiinista 158: n pitoisuudet vaihtelivat anaerobisesti kasvatettujen ja aerobisesti kasvatettujen solujen välillä. Koska P. aeruginosa saavutti anaerobisissa kasvuolosuhteissamme pienemmän solutiheyden kuin aerobisissa kasvuolosuhteissa, tiheydestä riippuvat muutokset proteiinin ilmentymisessä ovat saattaneet vaikuttaa anaerobisen kasvun aikana havaitsemaamme proteomiin. Bakteerien solutiheys on kuitenkin todennäköisesti yhtä rajallinen monissa ympäristön lokeroissa, joissa on niukasti useita ravintoaineita (mm.happi). Siksi havaitsemamme muutokset proteiinitasoissa auttavat ymmärtämään, miten bakteerien proteomi ja aineenvaihduntatila vaihtelevat reagoidessaan eri ympäristöihin. Bakteerien proteiinipitoisuuden suora analysointi on vankka tekniikka, jolla voidaan tarkkailla bakteerien sopeutumista tiettyihin ympäristön markkinarakoihin, mukaan lukien CF-hengitystiet.