discussão
este estudo fornece evidência de que as células β podem funcionar bem num local de enxerto sem células não β próximas. Para estudar Enxertos enriquecidos com células β, os ilhéus tiveram de ser dispersos em células únicas para permitir a separação de células activadas por fluorescência. Os nossos estudos iniciais investigaram, portanto, o efeito da dispersão de Ilhéus e da reagregação nos resultados da transplantação. Quando as células dispersas foram reagregadas antes do transplante, menos células foram necessárias para reverter a hiperglicemia. Após o IPGTTs, as ilhotas re-desagregadas tinham um perfil de glucose semelhante ao dos ratinhos de controlo não-diabéticos e não-transplantados. No entanto, os ratinhos transplantados com 2,5 milhões de células de ilhéu dispersas apresentaram níveis ainda mais baixos de glucose sanguínea após o teste de tolerância à glucose. Este resultado indica que o transplante de células de Ilhéus dispersos pode ser eficiente, desde que haja um número suficiente de transplantes. No entanto, se as células de ilhéu são reagregadas antes do transplante, metade do número de células pode restaurar a normoglicemia. Estes resultados estão em linha com vários estudos anteriores que mostraram que as respostas secretoras de insulina são diminuídas em células de Ilhéus dispersos e são melhoradas pela reagregação das células (24-27). Este resultado superior pode ser devido a uma influência positiva da comunicação celular sobre a secreção de insulina e levanta questões sobre se as células agregadas são mais resistentes à apoptose. É provável que as células dispersas formem aglomerados in vivo após o transplante, mas isso pode ocorrer após muitas células serem perdidas nos primeiros dias após o transplante. Em resumo, é evidente que um maior número de células dispersas são inicialmente necessárias para reverter a hiperglicemia.
no nosso próximo estudo, as células de ilhéu dispersas foram enriquecidas para células β através do uso de células fluorescentes activadas. as células-β foram separadas de acordo com a sua fluorescência endógena e dispersão para a frente (tamanho), como foi descrito anteriormente (19-21). Usando esta técnica, conseguimos obter populações celulares de ∼95% de células β. Estas fracções enriquecidas com células β foram então reagregadas antes do transplante. Os ratos transplantados com agregados enriquecidos com células β tiveram uma rápida reversão da hiperglicemia de uma forma semelhante à dos ratos transplantados com um volume semelhante de Ilhéus inteiros. Note-se que o número de células β teria sido menor nos transplantes de Ilhéus comparativamente aos transplantes de células β. É provável que os transplantes de células β, Com 95% de pureza de células β, contivessem ∼20% mais células β do que nas ilhotas. No entanto, o objectivo do estudo era determinar se as células β purificadas, transplantadas em volumes semelhantes aos utilizados no transplante de Ilhéus, poderiam reverter a diabetes e determinar se as células β derivadas de células estaminais poderiam alguma vez ser úteis para o transplante de doentes diabéticos. Nos testes de tolerância à glucose 4 semanas após o transplante, os ratinhos transplantados com agregados enriquecidos com células β apresentavam níveis de glucose sanguínea ligeiramente mais baixos e tinham tendência a ter níveis de insulina ligeiramente mais elevados do que os transplantados com Ilhéus. No entanto, ao fim de 12 semanas, não houve diferença entre estes grupos no que diz respeito à tolerância à glucose, aos níveis de insulina ou ao conteúdo de insulina do enxerto. Nesta série experimental, os ratos de controlo não-diabéticos e não-transplantados foram emparelhados com a idade e não com o peso emparelhado. Enquanto os pesos dos ratinhos transplantados permaneceram estáveis ou diminuíram durante o seu período de diabetes, os ratinhos de controlo continuaram a ganhar peso durante todo o estudo. A sua baixa tolerância à glucose e níveis mais elevados de insulina sugerem que estes ratinhos de controlo se tornaram resistentes à insulina. Além disso, os níveis mais baixos de glucose dos ratinhos transplantados podem ser explicados pelo facto de os ilhéus de rato terem sido implantados, porque os ratos têm tipicamente níveis de glucose mais baixos do que os ratinhos e podem ter um ponto de referência mais baixo para a secreção de insulina estimulada pela glucose.
estes resultados mostram que o resultado da transplantação de agregados enriquecidos com β-células é semelhante ao dos Ilhéus. O transplante de uma população purificada de células β foi previamente demonstrado por Keymeulen et al. (28) para ser bem sucedido, embora tenha sido sugerido neste estudo que a mistura de células endócrinas não–β com células β antes da transplantação melhorou a função do enxerto. No estudo Keymeulen, os enxertos foram estudados durante 64 semanas em vez das 12 semanas neste estudo. Os enxertos de células β e os enxertos mistos de células β e de células não-β endócrinas do rato funcionaram bem em ratos até ∼20 semanas, quando alguns Enxertos começaram a falhar. Em 64 semanas, todos os enxertos, independentemente de conterem células β purificadas ou células β misturadas com outras células não-β endócrinas, falharam parcial ou totalmente. No entanto, eles implantaram cerca de 1,2–1,7 milhões de células-β em ratos, o que poderia ser considerado como um modelo de massa mínima. Este estudo minucioso também mostrou que as células β de dadores de ratos mais velhos não funcionam bem como as células β de dadores de ratos mais jovens. Assim, o estudo Keymeulen complementa os achados do presente estudo em que ambos mostram função impressionante de enxertos consistindo de células β purificadas. Outro tipo de célula dentro de ilhotas que poderia potencialmente contribuir para o resultado do transplante é a célula endotelial, que tem sido relatada para contribuir para a revascularização de Ilhéus transplantados (15,16). No entanto, não é claro que haja células suficientes para dar um contributo significativo. No entanto, é evidente, a partir dos estudos actuais, que, embora as células endócrinas não–β e o endotélio dador possam ser benéficos para a função dos enxertos de Ilhéus transplantados, não parecem ser essenciais para um transplante bem sucedido. Este resultado indica que as células β derivadas in vitro de células estaminais ou de qualquer outra fonte podem ser muito úteis para fins de transplantação.Quando a composição do enxerto foi estudada 12 semanas após o transplante, os agregados enriquecidos com β–células tinham virtualmente os mesmos 5% de células não-β nos enxertos que nas preparações iniciais. Embora isto não fosse surpreendente, foi notável descobrir que os ilhéus que inicialmente tinham 25% de células não–β tinham apenas 5% dentro dos enxertos. A grande maioria destas células são células-α contendo glucagon. Se os enxertos enriquecidos com células β tivessem perdido células não-β no mesmo grau que os enxertos de ilhéu, seria de esperar que tivessem apenas 1% de células não–β após o transplante. É também intrigante que a perda de células não-β nos enxertos de ilhéu parasse em 5%, que era a mesma percentagem de células não–β encontradas nos Enxertos enriquecidos com células-β. De acordo com estas descobertas, também descobrimos que quando os aglomerados pancreáticos de suínos imaturos neonatais foram transplantados para ratos nus, os enxertos, muitos meses depois, eram de ∼95% de células β (29). Este fenómeno das experiências actuais com ilhéus de ratos pode ser explicado pela morte preferencial das células não–β, tal como descrito anteriormente (30-33). Estes estudos e os nossos concluem que a diminuição é principalmente contabilizada pelas células produtoras de glucagon (30-33). Não sabemos se as células δ e PP também desaparecem. A localização periférica das células α em ilhotas de roedores pode potencialmente torná-las mais vulneráveis a danos durante o isolamento. Embora não tenhamos estudado esta questão em pormenor no presente estudo, estudos anteriores indicaram que esta não é a principal razão para a perda de células α após o transplante. In a study by Lau et al. (33) as ilhotas implantadas no fígado perderam as células α às 4 semanas após o transplante, enquanto que as ilhotas implantadas no rim a partir do mesmo isolamento não tiveram, o que indica que os acontecimentos relacionados com o isolamento não causaram a perda destas células periféricas (33). Nesse estudo, os ilhéus implantados intraportalmente mostraram perda de células α, enquanto que os ilhéus implantados sob a cápsula renal não mostraram perda de células α. No presente estudo, vimos perda de células não-β em Ilhéus sob a cápsula renal 1 semana após a implantação. Uma diferença entre o seu estudo e este estudo é que implantaram Ilhéus em ratos normoglicémicos, enquanto que no presente estudo os receptores eram ratinhos hiperglicémicos. É possível que as diferenças na carga metabólica no enxerto de ilhéu possam afectar a sobrevivência das células α. Não se pode excluir que a perda de células α seja mais rápida no local do fígado, como Lau et al. (33)comunicado. Gunther et al. (31) relatou a perda de células α logo 2 dias após a implantação no fígado de ratos diabéticos (31). Uma vez que os níveis normais de glucagon e outros peptídeos derivados de células não–β ainda são produzidos pelo pâncreas endógeno, é possível que as células não-β nos Enxertos desapareçam devido à involução para prevenir a hiperglucagonemia.
a questão hipotética, que pode um dia ser de importância prática, é se um enxerto de células-β puras proporcionaria um resultado de transplante adequado. Em termos de efeitos metabólicos de todo o corpo da secreção de glucagon a partir de enxertos, parece que a secreção a partir de enxertos fornece proteção mínima contra a hipoglicemia aguda (34), no entanto os transplantes de Ilhéus humanos podem manter níveis de glicose quase normais. A secreção persistente de glucagon do pâncreas pode contribuir para a homeostase da glucose, mas, mais uma vez, pouca protecção contra a hipoglicemia aguda. Estas respostas deficientes de glucagon podem tornar os receptores mais propensos à hipoglicemia durante o exercício (35,36), mas é improvável que isso supere os benefícios. A próxima questão é se existe alguma influência local importante das ilhotas não-β-células na função β-célula. Considerando a anatomia microvascular dos Ilhéus e as experiências fisiológicas que mostram que as células não–β estão a jusante das células-β (13,14), parece provável que a maioria das células-β não sejam influenciadas por células-β. Algumas informações podem ser fornecidas por nossas medições que determinaram quão longe as células β estavam longe das células não-β. Quando quantificamos o número de células-β que estavam em estreita proximidade com uma célula não-β, descobriu-se que 65-75% das células–β eram 50 µm de uma célula não-β. Parece improvável que a secreção local de células não–β possa ter muita influência de paracrina a essa distância. Além disso, a partir de estudos de outros (37,38), sabemos que a microvasculatura das ilhotas transplantadas é muito diferente do normal. Assim, a anatomia dos enxertos de Ilhéus é muito diferente dos Ilhéus no pâncreas, mas estes Enxertos ainda são eficazes na reversão da hiperglicemia nos diabéticos destinatários.
em conclusão, descobrimos que agregados enriquecidos com β-células podem reverter efetivamente a hiperglicemia em ratinhos e que os ilhéus intactos transplantados estão esgotados em células não–β. Por conseguinte, é provável que as células não β dos Ilhéus não sejam essenciais para um transplante bem sucedido dos Ilhéus.