ELISA: hur man analyserar experimentella resultat

av Dr. Surat P, ph.d. Recenserad av Dr. Tomislav Me Exceptionaltrovi, MD, Ph. D.

ELISA, eller enzymbunden immunosorbentanalys, är ett verktyg som används för att detektera och kvantifiera ämnen, såsom peptider, proteiner, antikroppar och hormoner. Det involverar immobilisering av ett antigen eller antikropp på en yta, följt av tillsats av ett prov som ska analyseras. Detektion är beroende av en specifik antigen-antikroppsreaktion.

Jarun Ontakrai |

Vad ska man göra innan man kör en ELISA

ett ELISA-test ska alltid utföras i replikat (dubbletter eller triplikat) för att uppnå tillräckligt antal prover för att beräkna standardavvikelsen och koefficienten av variation. Felkoefficienten bör bibehållas mindre än 20%. Om det beräknade felet är högt måste fel som uppstår på grund av pipettering, kontaminering av plattor och reagens, avdunstning och/eller temperatur utvärderas.

standardkurva

en standardkurva används för att mäta provets koncentration. För det första plottas absorbansvärdena för standardkoncentrationer (pg/ml). En negativ kurva görs också som inte innehåller några standardprovdata och används för att upptäcka och mäta bakgrundsbrus. För en noggrann mätning måste detta bakgrundsvärde subtraheras från standardkurvan.

absorbansvärdena för känd koncentration kan ritas som en positiv kontroll. Koncentrationen av målproteinet härleds genom att först beräkna medelabsorbansen och sedan använda standardkurvan för att uppskatta koncentrationen.

Utspädningsfaktorer bör också beaktas. Till exempel, om provet har utspätt fyrfaldigt, bör absorbansen multipliceras med fyra innan standardkurvan används för att härleda koncentrationen.

variationskoefficient

definitionen av variationskoefficient är förhållandet mellan standardavvikelse och medelvärde – dvs. standardavvikelse (GHz)/medelvärde (USD). Stora värden på variationskoefficient indikerar felaktigheter på grund av pipettering eller blandning av reagens mellan brunnar, bakteriell eller svampförorening, uttorkning av brunnar eller temperaturvariationer.

Spike recovery

värdet som erhålls efter att ha kört ELISA-testet beror på hur ett riktat protein interagerar med antikropparna, och denna interaktion jämförs med en standardproteinkurva. Flera faktorer – inklusive buffert, matris och heterofila antikroppar – kan påverka bindningen av provet, så detta måste beaktas vid bestämning av noggrannheten hos en ELISA.

en spikanalys kan utföras för att bestämma noggrannheten för ELISA-resultat. I denna analys tillsätts eller spikas en känd mängd rekombinant protein i provet. Sedan mäts mängden material med hjälp av standardkurvan. Stora avvikelser i de uppmätta värdena kan indikera fel på grund av okända element i analysen.

Linjäritetsanalys

Linjäritetsanalys används också för att bestämma noggrannheten för ELISA. I detta fall späds det ’spetsiga provet’ seriellt till 1: 2, 1: 4 och 1: 8. Om koncentrationen av det förändrade provet detekteras och om resultaten inte visar en linjär förändring i mätningarna kan det indikera fel i Elisa: s noggrannhet.

i vissa fall kan fel observeras vid vissa koncentrationer och inte längre observeras vid lägre koncentrationer. I sådana fall kan provet behöva spädas innan koncentrationsmätningarna utförs.

felsökning

bakgrundsbrus kan orsakas av ett antal faktorer, inklusive:

• otillräcklig tvättning av brunnarna
• förorenade tvättbuffertar
• för mycket detekteringsreagens
• korsreaktivitet hos antikroppen
• utfällning av bufferten och/eller analyten

ibland kan dålig standardkurva genereras. Detta kan bero på fel i standardlösning, nedbrytning av standard, standard är felaktigt rekonstituerad, eller om kurvan inte passar skalan. Med tanke på det senare kan plottning göras med olika skalor, såsom log-log eller 5 parameter logistisk kurva.

Vidare läsning

• Allt innehåll av enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA)
• ELISA-applikationer
• Western Blot-Lab-teknik som används för att detektera proteiner
• Antikroppsapplikationer
• Genuttrycksmätning

skriven av

Dr. Surat P

Dr. Surat examen med en Ph. D. i cellbiologi och Mekanobiologi från Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, Indien) 2016. Före sin doktorsexamen studerade Surat för en kandidatexamen (B.Sc.) examen i zoologi, under vilken hon var mottagare av en Indian Academy of Sciences Summer Fellowship för att studera proteinerna som är involverade i AIDs. Hon producerar artiklar om ett brett spektrum av ämnen, såsom medicinsk etik, datamanipulation, pseudovetenskap och vidskepelse, utbildning och mänsklig utveckling. Hon brinner för vetenskapskommunikation och skriver artiklar som täcker alla områden inom biovetenskap.

citat