ADP-ribosylering
under lång tid tros funktionen av koenzym NAD vara relaterad till dess roll i redoxreaktioner. Men under de senaste 20 åren föreslog experimentella bevis att NAD deltar i ADP-ribosyleringshändelser.
i NAD frigör klyvningen av glykosidbindningen mellan C1′ av ribos och N11 av nikotinamid nikotinamid och ADP-ribosyl (Fig. 24.1). Detta kan fästas till en mängd olika acceptormolekyler. Många nad-beroende reaktioner för överföring av ADP-ribos (ADP-ribosylering) är kända; alla är av stor funktionell betydelse.
figur 24.1. ADP-ribos.
Mono-ADP-ribosylering. I denna posttranslationella modifiering överförs ADP-ribosylen från NAD till en aminoacylrest (arginin, cystein, asparagin eller histidin) av ett acceptorprotein. Det bör noteras att bindningen av ADP-ribosylnikotinamid i NAD är en hög energibindning; dess bristning ger den energi som gör reaktionen möjlig. Mono-adenosindifosfat-ribosyltransferas (ART), som ursprungligen beskrivs i bakterietoxiner och senare i eukaryota celler, katalyserar reaktionen.
Koleratoxin främjar överföringen av mono-ADP-ribosyl till subenheten av GS-protein i Cu och aktiverar det. Detta leder till stimulering av adenylatcyklas, ökning av cykliska AMP-nivåer och högre funktion av jontransportkanaler i det luminala membranet hos enterocyter. Detta orsakar svår diarre, ett karakteristiskt symptom på kolera toxininfektion. Pertussistoxinet (producerat av bakterierna som orsakar kikhosta) bestämmer ADP-ribosylering av cysteinylrester och kopplar bort G-protein från dess receptor. Difteritoxin och Pseudomonas exotoxin stoppar proteinsyntesen genom ADP-ribosylering av förlängningsfaktor 2 (EF2). Clostridium toxin ADP-ribosylater aktinmolekyler och förhindrar dess polymerisation. Dessa åtgärder visar att mono-ADP-ribosyleringen markant påverkar funktionen hos det modifierade proteinet.
hos människor har flera ADP-ribosyleringsenzymer erkänts. Vissa förankras av glykosyl-fosfatidylinositol till plasmamembranets yttre yta (ectoenzymer) och andra ligger i cellen (endoenzymer).
upptäckten av ectoenzymer som verkar på NAD som finns i cellerna var slående. Man tror att dessa enzymer använder NAD som släpps ut i det interstitiella utrymmet av lyserade celler; alternativt har förekomsten av kanaler som tillåter utträde av NAD genom plasmamembranet föreslagits. Ectoenzymerna är funktionellt associerade med moduleringen av myocytdifferentiering och andra processer associerade med immun-och inflammatoriska svar, såsom kemotaxi, rekrytering av neutrofiler, hämning av T-cellcytotoxicitet och celladhesion.
intracellulära ARTs är involverade i reglering av signaltransduktionssystem där G-proteiner är involverade och fungerar som ART-substrat. Mono-ADP-ribosyleringen kan påverka signalering och främja olika cellulära effekter. Hämning av proteinöversättning, reglering av Golgi-apparaten och cytoskeletonfunktionen är ett resultat av dessa posttranslationella modifieringar.
Poly-ADP-ribosylering. Detta är en annan typ av posttranslationell modifiering katalyserad av poly-adenosindifosfat-ribosylpolymeraser (PARP). Arton PARP-gener har identifierats, men inte alla enzymer som kodas av dessa gener har karakteriserats. PARP binder initialt ADP-ribosyl till glutamyl-eller aspartyl-rester i acceptorproteinet. Sedan fortsätter det att införa ADP-ribosylmolekyler och fästa dem linjärt med glykosidiska 1′
2 ’ – bindningar. Vid varje 40-50 enheter skapas grenpunkter i huvudkedjan och sätter in 1’3′ – bindningar. PARP kan också genomgå auto-poly-ADP-ribosylering; ett av de viktigaste substraten för PARP är PARP själv.
ADP-ribospolymerer är mycket elektronegativa och påverkar egenskaperna hos det modifierade proteinet. Ökningen i proteinnegativ laddning ökar repulsionen av ADP-ribosylerat protein med andra polyanioner, såsom DNA; eller lockar positivt laddade molekyler, såsom histoner.
bland de kända ADP-ribosylpolymeraserna finns vissa i kärnan. PARP – 1 och PARP-2 aktiveras genom närvaron av klyvda ställen i DNA-strängarna, till vilka PARP binder. Dessa klyvda platser uppträder vanligtvis under DNA-replikation och reparation, eller kan orsakas av externa medel. PARP-3, är ofta associerad med centrosomen och PARP-4 är associerad med ribonukleoproteinpartiklar. PARP-7 och PARP-10 är involverade i Histon ribosylering. TNKS och TNKS-2 är också poly-ADP-ribosylpolymeraser och de är associerade med telomerer.
modifieringen genom poly-ADP-ribosylering av basiska proteiner, såsom histoner, förändrar DNA-histoninteraktioner såväl som intra – och internukleosomattraktioner, vilket främjar en lösare kromatinstruktur. Detta underlättar tillgången till DNA av enzymer som är involverade i processerna för replikering och reparation, inklusive helikas, topoisomeras, polymeras och ligas. PARP-ADP-auto-polyribosylatet tenderar att avvisa närliggande DNA-strängar när dess elektronegativa laddning ökar och slutligen separerar.
PARP associerad med telomerer främjar telomerasaktivitet vid kromosomförlängning. Dessutom tjänar deras närvaro till att avvisa andra DNA-strängar och förhindra avvikelser, såsom translokationer och end-to-end eller skadliga rekombinationsfusioner.
Poly-ADP-ribosylering av vissa enzymer kan modifiera deras aktivitet; till exempel kan det stimulera DNA-ligas och hämma endonukleas, vilket förhindrar DNA-nedbrytning.
PARP är involverad i reglering av kromatinstruktur, transkription, replikering, reparation, underhåll av DNA-integritet och stimulering av DNA-ligas. Frånvaron eller minskningen av PARP-aktivitet leder till genominstabilitet.
PARP associerad med centrosomer bidrar till en ordnad separation av kromosomer under mitos.
PARP är också involverad i celldifferentiering och proteinnedbrytning under programmerad celldöd (apoptos, Kapitel 32). Handlingsmekanismerna är ännu inte klart förstådda. PARP förmedlar apoptos genom proinflammatoriska signaler. Det styr frisättningen av apoptosinducerande faktor (AIF) från mitokondrier. Nya studier har också visat ett samband mellan poly-ADP-ribosylering och polyubiquitination i märkning av proteiner för nedbrytning.
vid cellstress kan överaktivering av PARP leda till utarmning av NAD och ATP, med förödande konsekvenser för cellen som slutar i cellnekros.
studier på laboratoriedjur har visat att ischemiska tillstånd, i hjärnan och hjärtat, under septisk chock eller svåra inflammatoriska processer förbättras när PARP hämmas. Det är troligt att dessa observationer kommer att ha klinisk tillämpning; emellertid måste utmaningen med minskad ADP-ribospolymerasaktivitet som leder till genomdestabilisering, ackumulering av mutationer och så småningom till malign transformation (karcinogenes) först lösas.
ADP-ribospolymererna bryts ned av polyadp-ribosglykohydrolas, som frigör fri ADP-ribos. Ett ADP-riboslyas frigör den första enheten som är fäst vid proteinet. Pyrofosfatas separerar AMP och ribosfosfat.
NAD-beroende deacetylering. Det finns en proteinfamilj av NAD-beroende deacetylaser som kallas sirtuiner, som frigör nikotinamidgruppen från NAD och använder acetat separerat från proteiner som en ADP-ribosylacceptor för att bilda 2′-O-acetyl-ADP-ribos. Denna aktivitet observerades först i jäst och betecknades med akronymen SIR (silent information regulator); senare demonstrerades det också i nematoden Caenorhabditis elegans och i Drosophila melanogaster. Deras verkan ökar livslängden för dessa organismer, särskilt under förhållanden där näringsämnen i mediet är begränsade.
Sirtuiner (SIRT) består av en familj av sju proteinmedlemmar (SIRT-1 till SIRT-7), som kan betraktas som en variant av ADP-ribosylaser. De använder olika substrat, såsom histoner, p53-protein, transkriptionsfaktorer, kärnfaktor kB och andra. Till exempel inducerar histondeacetylering en mer kompakt struktur av kromatin, vilket främjar gendämpning och skyddar kritiska områden av kromosomer, såsom telomerer och centrosomer. Deacetylering av protein p53 är viktigt för genomisk stabilitet; Det styr cellcykeln, DNA-reparation och apoptos. Deacetylering av p53 ökar tydligen dess stabilitet genom att blockera ubiquitination.
SIRT 1 är involverad i energisk metabolism, oxidativ stressrespons, cell senescens och skydd av vaskulär endotel och nerver i olika patologiska tillstånd.
nikotinamid frisatt från NAD-beroende deacetyleringar fungerar som en potent hämmare av sirtuins aktivitet, vilket bidrar till dess reglering.
eftersom sirtuins verkan bidrar till förlängning av livet i vissa organismer, ansågs det vara en allmän förlängningsfaktor. Det finns dock inte tillräckligt med bevis för att extrapolera dessa resultat till högre djur.
man tror att upprätthållandet av normala nivåer av poly-PARP-polymeraser och sirtuiner i cellerna kan förhindra eller fördröja karcinogenes och åldringsrelaterade störningar.
produkten 2′-O-acetyl-ADP-ribos, som härrör från sirtuinaktivitet, fungerar som en andra budbärare.
reaktioner som inte är relaterade till protein posttranslationell modifiering, men kan betraktas som varianter av ADP-ribosylering, genererar föreningar med viktig fysiologisk verkan: cyklisk ADP-ribos och nikotinsyra-ADP-ribosfosfat (NAADP) (se s. 669).