PMC

HCV RNA-kvantifiering.

syftet med denna studie var att utveckla en enkel QRT-PCR-analys i realtid för kvantifiering av HCV RNA i både serum-och leverprover med SYBR Green i-detektion snarare än användning av märkta sonder. QRT-PCR-analyser i realtid utfördes med en LightCycler (Roche) med både enrund förstärkning och en ny kapslad amplifiering med begränsad cykel. RNA-standarder transkriberades med T7-polymeras från amplikoner härledda från 5 ’ otranslaterade Region PCR-produkter klonade till pGEM – t Easy (Promega) och behandlades två gånger med RQ1-DNas. RNA kvantifierades genom spektrofotometri. För enrund kvantifiering av serumprover transkriberades RNA omvänd såsom beskrivits tidigare (7). För kvantifiering av kapslad PCR med begränsad cykel utfördes en RT-PCR i en enstegsreaktion med 15 cykler av PCR (steget med begränsad cykel), följt av en realtid QRT-PCR. HCV-belastningar mättes med realtids-PCR med yttre primers KY78 och KY80 för enrunda reaktioner (21) eller yttre primers plus inre primers hep21b och hep22 för kapslade reaktioner i begränsad cykel (19). Reaktionsblandningar inkluderade 2 occl Snabbstart DNA Master SYBR Green i (Roche), 4 mM MgCl2, en 0,5 occlm koncentration av varje primer och 2 occl av mallen i en total volym av 20 occl. Efter inkubationer för 10 min vid 95 CCB utfördes LightCycler PCR för 40 cykler, varje cykel bestående av 15 s vid 95 CCB, glödgning vid 60 CCB för 5 s och förlängning vid 72 CCB för 10 s. Fluorescens övervakades vid 530 nm, och signalens specificitet kontrollerades genom smältkurvanalys.

med syntetiskt HCV-RNA som mall var känsligheten för QRT-PCR-analysen i enrundan i realtid cirka 103 HCV-kopior/reaktion eller 5 104 kcal/ml när utspädningsfaktorn beräknades. Ett brett linjärt förhållande observerades (upp till 6,5 108 kopior/reaktion av 108-kopior) mellan antalet PCR-cykler som behövs för att detektera en fluorescenssignal och antalet HCV-kopior. Vi mätte serumvirusbelastningen på 24 patienter kroniskt infekterade med olika HCV-genotyper som förekommer i Australien (1a, 1b, 2a, 2b, 2c och 3a) (6). Tre patienter hade virusbelastningar under känsligheten för denna version av analysen (5 104 kopior av 104 ml), även om de var positiva genom en kvalitativ intern kapslad RT-PCR-analys (19). De återstående 21 patienterna hade virusbelastningar som varierade från 2,8 105 till 9,1 106 kopior/ml. För att öka analysens känslighet och specificitet infördes en 15-cykel, enstegs RT-PCR med en efterföljande kvantitativ PCR i realtid för andra omgången. Med syntetiskt RNA kunde den modifierade metoden detektera ett brett spektrum av HCV-kopieringsnummer (från 28 till 2,8 106 HCV-kopior/reaktion i 106-format) samtidigt som linjäriteten bibehölls. Känsligheten för den kapslade QRT-PCR-analysen med begränsad cykel var större än 28 kopior/reaktion (eller 1400 kopior/ml), vilket var ungefär 40 gånger större än den för QRT-PCR-analysen med en runda. Känsligheten för denna analys jämförs positivt med de tidigare rapporterade metoderna med användning av realtidskvantisering med TaqMan-teknik (Roche) och ett ABI Prism 7700 sekvensdetekteringssystem (Perkin-Elmer), som har rapporterat känslighet för 10 kopior/reaktion (9, 16) och 1000 kopior/reaktion (12). Känsligheten hos LightCycler (Roche) och SYBR grön i detektion har också rapporterats vara 10 kopior/reaktion (10). För att ytterligare validera denna version av analysen, de virala belastningarna av 16 HCV-positiva serumprover, som varierade från 1 103 till 1.2 msk. 106 kopior/ml (som bestämts med Amplicor Monitor-analysen) visades korrelera nära med resultat erhållna med den kapslade QRT-PCR-analysen i realtid (r= 0,876, P < 0,0001, n = 16) (Fig. (Fig.11).

HCV replikerar i levern, men få studier har försökt att relatera virusbelastningar i levern till kliniska resultat, och föredrar att undersöka det prediktiva värdet av serumvirusbelastningar. Det senare kan betraktas som ett lämpligt surrogat för hepatiska virusbelastningar om de visade sig korrelera, men få studier har visat detta och de resultat som hittills rapporterats är inte övertygande. Den kapslade QRT-PCR-analysen med begränsad cykel användes därför för att mäta hepatisk HCV-belastning. Mängden levervävnad som användes för analys vägde mellan 0, 8 och 8, 1 mg (medelvärde = 3.88 2,1 mg 2,1 mg), från vilken 2,1 till 12,9 (medelvärde = 6,62 3,1 3,1 MGC.) RNA extraherades. Utbytet av totalt RNA var i genomsnitt 1,71 103 103 kg / g levervävnad, ett värde som liknar det som hittades i en tidigare studie av 1,01 103 103 kg RNA / g (13). Nedsatt viral massor varierade från 3,0 × 102 1,3 × 106 HCV RNA-molekyler/(µg av summa RNA, och genomsnittet var 2.38 × 105 ± 3.55 × 105 kopior/µg av RNA. En korrelation har visats mellan levervirusbelastningar, mätt i termer av antalet HCV-kopior per mikrogram totalt RNA och serumvirusbelastningar uppmätta med Amplicor Monitor-analysen, även om den var svag (r = 0, 417, n = 20) (13). Andra studier har visat att HCV-RNA-belastningen i serum väsentligen reflekteras av mängden virus i levern utan att ge korrelationskoefficienter (3, 8). Här rapporterar vi för första gången en statistiskt signifikant korrelation mellan lever-och serumviralbelastningsmätningar (r = 0.689, P = 0.004, n = 15), vilket indikerar att nivån av viremi faktiskt återspeglar mängden virus som finns i levern (Fig. (Fig.22).

i tidigare studier har leverviralbelastningsmätningar uttryckts som antalet kopior per milligram levervävnad eller antalet kopior per mikrogram totalt RNA. I denna studie visar vi att endera enheten verkar vara lämplig, eftersom det fanns en signifikant korrelation mellan virusbelastningar mätt i termer av antalet kopior per milligram levervävnad och de uppmätta som antalet kopior per mikrogram totalt RNA (r = 0.937, P < 0.0001, n = 20) (Fig. (Fig.3).3). Dessa resultat överensstämmer med de Moliner et al. (3), who visade också en nära korrelation mellan virusbelastningen i levern, uttryckt som antalet kopior per gram vävnad och antalet kopior per mikrogram totalt cellulärt RNA (r = 0,85) (3). Det genomsnittliga antalet av HCV-RNA-molekyler per gram av levervävnad var 2,1 × 108 ± 3.71 × 108, runt 170 gånger högre än RNA-nivåer i serum (1.22 × 106 ± 2.0 × 106 kopior/ml). Detta resultat liknar Terrault et al. (18), som visade att förhållandet mellan HCV RNA i levern och det i serum var 103:1. I kontrast, McGuiness et al. (13) fann att nivån i levervävnad var större med en faktor >104. Denna skillnad kan relatera till det faktum att de hepatiska viral massor av patienterna i den tidigare studien, som främst hade avancerat HCV-infektion, var runt åttafaldiga högre (1.83 x 106 ± 0.75 × 106 kopior/µg RNA) än de som registrerats i denna studie (2.38 × 105 ± 3.55 × 105 kopior/µg RNA).

Sammanfattningsvis är QRT-PCR-analysen i realtid en känslig, exakt och pålitlig metod för övervakning av HCV-belastningar i både serum-och leverprover.