DNA gelová elektroforéza je technika používaná k oddělení a identifikaci fragmentů DNA na základě velikosti.
DNA fragmenty různé velikosti jsou načteny do porézní gel z agarózy – sacharidy nalezené v červené řasy.
při aplikaci elektrického pole budou fragmenty migrovat přes gel díky záporně nabitým fosfátovým skupinám v nukleotidech DNA.
menší kousky DNA budou snadněji migrovat přes gel než větší fragmenty,které mají obtížnější pohyb přes gelovou matrici.
po dokončení běhu gelu lze umístění vašich vzorků DNA porovnat s řadou fragmentů nebo pásů známých velikostí, nazývaných dna žebřík.
přítomnost vašeho fragment zájmu pak může být potvrzena na základě jeho velikosti, která je stanovena porovnáním relativní umístění zkušebního vzorku do fragmentů žebříku.
Agarózové gely se připravují za použití roztoku v procentech hmotnosti nad objemem. Takže 1 gram agarózy ve 100 ml pufru vytvoří 1% gel. Nižší procento gelů lépe vyřeší větší fragmenty a vyšší procento gelů usnadní identifikaci menších fragmentů. Začít gelu-dělat postup, naváží příslušné množství agarózy do Erlenmeyerovy baňky.
přidejte do baňky běžící pufr, aby objem pufru nebyl větší než 1/3 kapacity baňky. Pak se víří, aby se promíchal.
směs agarózy a pufru roztavte zahříváním v mikrovlnné troubě při maximálním výkonu. Každých třicet sekund vyjměte baňku a obsah vířte, aby se dobře promíchal. Opakujte, dokud se agarosa úplně nerozpustí.
Dále přidejte ethidiumbromid na koncentraci 0,5 mg / ml. Ethidiumbromid je aromatická sloučenina, která zapadá mezi jednotlivé páry bází DNA nebo interkaláty a způsobuje, že DNA emituje intenzivní oranžovou fluorescenci pod UV světlem. Je důležité si uvědomit, že ethidiumbromid je karcinogen, takže při manipulaci s gely obsahujícími tuto sloučeninu by se měly vždy nosit rukavice.
Chcete-li zabránit deformaci gelové misky, nechte agarózu vychladnout umístěním do vodní lázně o teplotě 65 ° C.
jak se agaróza ochlazuje, připravte gelovou formu umístěním gelové misky do licího zařízení. Jako alternativu můžete použít pásku k utěsnění otevřených okrajů gelové misky k vytvoření formy. Umístění hřebenu do gelu vytvoří jamky, kde je načtena DNA. Ujistěte se, že hřeben vytvoří studnu odpovídající velikosti pro váš vzorek DNA.
nalijte roztavenou agarózu do gelové formy a nechte ji ztuhnout při pokojové teplotě.
po vytvrzení agarózy vyjměte hřeben. Pokud gel nebude použit okamžitě, zabalte jej do plastového obalu a skladujte při 4 ° C až do použití.
pokud má být gel použit okamžitě, vložte jej do gelové krabičky.
Chcete-li zahájit tento postup, přidejte do vzorků DNA, které mají být odděleny, barvivo zavádějící gel. Nakládací barvivo se obvykle vyrábí v koncentraci 6X. Loading dye pomáhá vizualizovat a načíst vzorky do jamek a pomáhá určit, jak daleko vzorky migrovaly během běhu.
nastavte napájení na požadované napětí.
Nyní přidejte do gelové krabičky dostatek běžícího pufru, který pokryje povrch gelu. Ujistěte se, že používáte stejný běžící pufr jako ten, který byl použit k přípravě gelu.
připojte vodiče gelové krabice k napájení a zapněte ji. Pamatujte, že DNA je záporně nabitá a bude se pohybovat směrem k anodě, která je pozitivní a obecně červená. Ujistěte se, že nepřipojujete černý kabel nebo katodu ke spodní části gelové krabice. Takže nezapomeňte, mějte na paměti, že černé kočky mají smůlu nebo negativní, a Černá katoda je tedy negativní. Spusťte gel na červenou nebo anodu. Ověřit, zda gelová skříňka i napájecí zdroj fungují; vzhled bublin na elektrodách naznačuje, že proud prochází.
sejměte víko gelové krabičky. Pomalu a opatrně vložte vzorky DNA do gelu. Opět platí, že načítání barviva ve vzorku umožňuje vzorku ponořit se do gelu a pomůže sledovat, jak daleko vzorku cestoval. Značka velikosti DNA, nebo žebřík, by měl být vždy vložen spolu s experimentálními vzorky.
vyměňte víko. Znovu zkontrolujte, zda jsou elektrody zapojeny do správných slotů v napájecím zdroji.
zapněte napájení. Spusťte gel, dokud barvivo migruje do vhodné vzdálenosti.
po dokončení elektroforézy vypněte napájení a sejměte víko gelové krabice.
odstraňte gel z gelové krabičky a vypusťte přebytečný pufr na povrchu gelu. Umístěte gelový zásobník na papírové ručníky, aby absorboval veškerý zbývající běžící pufr.
Chcete-li vizualizovat fragmenty DNA, odstraňte gel z gelové misky a vystavte gel ultrafialovému světlu.
fragment DNA by se měl zobrazit jako oranžové fluorescenční pásy. Vyfoťte gel.
na konci experimentu řádně zlikvidujte gel a běžící pufr podle předpisů instituce. Opět nezapomeňte vždy zacházet s gelem a běžícími pufry v rukavicích, abyste zabránili expozici ethidiumbromidu.
Nyní, když jste viděli, jak provádět elektroforézu DNA gelu. Podívejme se na některé navazující aplikace a varianty této velmi užitečné metody.
zde vidíte výsledek elektroforézy agarózového gelu po oddělení produktů PCR. Fragmenty DNA vložené do gelu jsou viditelné jako jasně definované pásy. Standard DNA nebo žebřík by měly být odděleny do té míry, která umožňuje užitečné stanovení velikostí vzorkových pásem. V tomto příkladu, DNA fragmenty 765 párů bází, 880 párů bází a 1022 párů bází jsou rozděleny na 1,5% agarózovém gelu s 2-log DNA ladder.
kromě potvrzení přítomnosti zajímavého fragmentu DNA lze elektroforézu DNA gelu kombinovat s postupy čištění gelu. Typicky se žiletka používá k vyříznutí fragmentu DNA, který je předmětem zájmu, aby mohl být odebrán a vzorek DNA v něm obnoven.
Agarózového gelu electrophesis může také být kombinovány s převodem blotting, které zahrnuje, což DNA, nebo RNA, transfer na celulózové membráně, kde je radioaktivní sondy mohou být použity k identifikaci konkrétní DNA nebo RNA sekvence ve vašem electrophoretically oddělený vzorek.
standardní dna gelová elektroforéza není ideální pro separaci DNA s vysokou molekulovou hmotností větší než 15-20 kb, jako je genomová DNA. K oddělení velkých vzorků DNA se používá gelová elektroforéza pulzního pole, která zahrnuje vystavení gelu měnícímu se nebo pulzujícímu elektrickému poli v různých směrech. Tato technika zahrnuje specializované gelové běžící zařízení, které má páry elektrod uspořádaných v různých orientacích kolem gelu. To může být použit k detekci rozdílů v genomu velikostí mezi populacemi organismů, jako směsné vzorky DNA z různých mikrobiálních společenstev, můžete vidět zde, což jsou převzaty z různých jezera prostředí.
právě jste viděli úvod do elektroforézy DNA gelu. Ukázali jsme vám koncept metody, jak připravit agarózový gel, jak načíst vzorky, jak spustit gel a analyzovat jej a některé běžné aplikace elektroforézy agarózového gelu. Díky za sledování a hodně štěstí při běhu gelu.