ELISA: Jak Analyzovat Experimentální Výsledky

Dr. Surat P, Ph.d. Přezkoumány Dr. Tomislav Meštrović, MD, Ph.d.

ELISA, nebo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, je nástroj, který slouží k detekci a kvantifikaci látek, jako jsou peptidy, proteiny, protilátky a hormony. To zahrnuje imobilizaci antigenu nebo protilátky na povrch, následuje přidání vzorku k analýze. Detekce závisí na specifické reakci antigen-protilátka.

Jarun Ontakrai |

Co dělat před spuštěním ELISA

testu ELISA by měla být vždy provedena v replikátech (opisy nebo kopie) tak, aby bylo dosaženo dostatečný počet vzorků pro výpočet směrodatné odchylky a variačního koeficientu. Koeficient chyby by měl být udržován méně než 20%. Pokud je vypočtená chyba vysoká, je třeba vyhodnotit chyby vzniklé v důsledku pipetování, kontaminace desek a činidel, odpařování a/nebo teploty.

standardní křivka

pro měření koncentrace vzorku se používá standardní křivka. Nejprve jsou vyneseny hodnoty absorbance standardních koncentrací (pg / ml). Také se provádí záporná křivka, která neobsahuje žádná standardní vzorová data a používá se k detekci a měření šumu pozadí. Pro přesné měření musí být tato hodnota pozadí odečtena od standardní křivky.

hodnoty absorbance známé koncentrace mohou být vyneseny jako pozitivní kontrola. Koncentrace cílového proteinu je odvozena nejprve výpočtem střední absorbance a poté pomocí standardní křivky pro odhad koncentrace.

je třeba vzít v úvahu také ředicí faktory. Například, pokud byl vzorek zředěn čtyřnásobně, pak by měla být absorbance vynásobena čtyřmi před použitím standardní křivky pro odvození koncentrace.

variační Koeficient

definice variační koeficient je poměr směrodatné odchylky a průměru – tj. standardní odchylka (σ)/průměr (µ). Velké hodnoty variačního koeficientu naznačuje, nepřesnosti vzhledem k pipetování nebo míchání reagencií mezi vrty, bakteriální nebo plísňové kontaminace, vysychání studní, nebo změny teploty.

Spike recovery

hodnota získaná po spuštění testu ELISA záleží na tom, jak cílené protein interaguje s protilátkami, a tato interakce je ve srovnání se standardní protein křivky. Několik faktorů-včetně pufru, matrice a heterofilních protilátek-může ovlivnit vazbu vzorku, proto je třeba to vzít v úvahu při určování přesnosti ELISA.

pro stanovení přesnosti výsledků ELISA může být proveden bodový test. V tomto testu je známé množství rekombinantního proteinu přidáno nebo vstřiženo do vzorku. Poté se pomocí standardní křivky měří množství materiálu. Velké odchylky v naměřených hodnotách mohou naznačovat chyby způsobené neznámými prvky v testu.

Linearity assay

Linearity assay se také používá ke stanovení přesnosti ELISA. V tomto případě se „špičatý vzorek“ sériově zředí na 1:2, 1:4 a 1:8. Pokud je zjištěna koncentrace změněného vzorku a pokud výsledky nezobrazují lineární změnu měření, může to znamenat chyby v přesnosti ELISA.

v některých případech mohou být pozorovány chyby při určitých koncentracích a již nejsou pozorovány při nižších koncentracích. V takových případech může být nutné vzorek před provedením měření koncentrace naředit.

řešení Problémů

hluk v Pozadí může být způsobena řadou faktorů, včetně:

• Nedostatečné promytí jamek
• umyjte Kontaminované pufry
• moc detekční činidla
• Cross-reaktivita protilátek
• Vysrážení pufru a/nebo analytu

Někdy, chudé standardní křivky mohou být generovány. To může být způsobeno chybami ve standardním roztoku, degradací standardu, standard je nesprávně rekonstituován nebo pokud křivka neodpovídá stupnici. Vzhledem k posledně uvedenému lze Vykreslování provádět pomocí různých měřítek, jako je log-log nebo logistická křivka 5 parametrů.

Další Čtení

• Všechny Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Obsah
• ELISA Aplikace
• Western Blot – Laboratorní Technika Používaná k Detekci Proteinů
• Protilátky Aplikace
• Genové Exprese Měření

Napsal

Dr. Surat P

Dr. Surat absolvoval s doktorát. v buněčné biologii a Mechanobiologii z Institutu základního výzkumu Tata (Bombaj, Indie) v roce 2016. Před jejím Ph.D., Surat studoval na Bachelor of Science (B.Sc,) titul v zoologii, během kterého byla příjemcem letního Stipendia indické Akademie věd ke studiu proteinů zapojených do AIDs. Produkuje celovečerní články o široké škále témat, jako je lékařská etika, manipulace s daty, pseudověda a pověra, vzdělání, a lidská evoluce. Je nadšená vědeckou komunikací a píše články pokrývající všechny oblasti věd o živé přírodě.

Citace