DNA-gelelektroforese er en teknik, der bruges til at adskille og identificere DNA-fragmenter baseret på størrelse.
DNA – fragmenter i forskellige størrelser lægges i en porøs gel fremstillet af agarose-et kulhydrat, der findes i røde alger.
når et elektrisk felt påføres, vil fragmenterne migrere gennem gelen takket være de negativt ladede fosfatgrupper i DNA-nukleotider.
mindre stykker DNA vil lettere migrere gennem gelen end større fragmenter, som har en vanskeligere tid at bevæge sig gennem gelmatricen.
når gelkørslen er færdig, kan placeringen af dine DNA-prøver sammenlignes med en række fragmenter eller bånd af kendte størrelser, kaldet en DNA-stige.
tilstedeværelsen af dit fragment af interesse kan derefter bekræftes baseret på dets størrelse, hvilket bestemmes ved at sammenligne den relative placering af din testprøve med fragmenterne af stigen.
agarosegeler fremstilles ved anvendelse af en vægt over volumenprocentopløsning. Så 1 gram agarose i 100 ml buffer vil gøre en 1% gel. Lavere procent geler vil bedre løse større fragmenter, og højere procent geler vil gøre mindre fragmenter lettere at identificere. For at starte gelfremstillingsproceduren skal du afveje den passende masse agarose i en Erlenmeyer-kolbe.
tilføj løbende buffer til kolben, så buffervolumenet ikke er større end 1/3 af kolbens kapacitet. Derefter hvirvles for at blande.
Smelt agarose/bufferblandingen ved opvarmning i en mikrobølgeovn ved maksimal effekt. Hvert tredive sekund skal du fjerne kolben og hvirvle indholdet for at blande godt. Gentag, indtil agarosen er helt opløst.
dernæst tilsættes ethidiumbromid til en koncentration på 0,5 mg/ml. Ethidiumbromid er en aromatisk forbindelse, der passer ind mellem individuelle basepar af DNA eller interkalater og får DNA til at udsende intens orange fluorescens under UV-lys. Det er vigtigt at bemærke, at ethidiumbromid er kræftfremkaldende, så handsker bør altid bæres ved håndtering af geler, der indeholder denne forbindelse.
for at forhindre, at gelbakken vrider sig, lad agarosen køle af ved at placere den i et vandbad på 65 liter.
når agarosen afkøles, forberedes gelformen ved at placere gelbakken i støbeapparatet. Som et alternativ kan du bruge tape til at forsegle de åbne kanter på gelbakken for at skabe formen. Placering af en kam i gelen skaber brøndene, hvor DNA er indlæst. Sørg for, at kammen skaber en brønd, der er den passende størrelse til din DNA-prøve.
hæld den smeltede agarose i gelformen og lad den hærde ved stuetemperatur.
efter at agarosen er hærdet, tag kammen ud. Hvis gelen ikke skal bruges med det samme, skal du pakke den ind i plastfolie og opbevare ved 4 liter indtil brug.
hvis gelen skal bruges med det samme, skal du placere den i gelboksen.
for at påbegynde denne procedure tilsættes gelbelastningsfarvestof til de DNA-prøver, der skal adskilles. Indlæsningsfarvestof fremstilles typisk i en 6 gange koncentration. Indlæsning af farvestof hjælper med at visualisere og indlæse prøver i brøndene og hjælper med at bestemme, hvor langt prøverne er migreret under løbet.
Indstil strømforsyningen til den ønskede spænding.
Tilføj nu nok løbende buffer i gelboksen til at dække gelens overflade. Sørg for at bruge den samme løbende buffer som den, der blev brugt til at forberede gelen.
tilslut ledningerne på gelboksen til strømforsyningen, og tænd den. Husk, at DNA er negativt ladet og vil bevæge sig mod anoden, som er positiv og generelt rød i farven. Sørg for ikke at forbinde den sorte ledning eller katoden til bunden af gelboksen. Så du glemmer ikke, husk at sorte katte er uheld eller negative, og den sorte katode er derfor negativ. Kør din gel til rød eller anoden. For at kontrollere, at både gelboksen og strømforsyningen fungerer; udseendet af bobler ved elektroderne indikerer, at strømmen passerer igennem.
fjern låget på gelboksen. Læg langsomt og forsigtigt DNA-prøverne i gelen. Igen tillader belastningsfarvestoffet i prøven prøven at synke ned i gelen og vil hjælpe med at spore, hvor langt prøven har rejst. En DNA-størrelsesmarkør eller stige skal altid indlæses sammen med de eksperimentelle prøver.
Sæt låget på igen. Dobbelttjek, at elektroderne er tilsluttet de korrekte slots i strømforsyningen.
Tænd for strømmen. Kør gelen, indtil farvestoffet er migreret til en passende afstand.
når elektroforese-kørslen er afsluttet, skal du slukke for strømforsyningen og fjerne låget på gelboksen.
Fjern gelen fra gelboksen og tøm overskydende buffer af på overfladen af gelen. Læg gelbakken på papirhåndklæder for at absorbere eventuel resterende kørende buffer.
for at visualisere DNA-fragmenterne skal du fjerne gelen fra gelbakken og udsætte gelen for ultraviolet lys.
DNA-fragment skal vises som orange fluorescerende bånd. Tag et billede af gelen.
ved afslutningen af eksperimentet skal gelen og den løbende buffer bortskaffes korrekt i henhold til institutionens regler. Husk igen altid at håndtere gelen og løbende buffere med handsker for at undgå ethidiumbromideksponering.
nu hvor du har set, hvordan du udfører DNA-gelelektroforese. Lad os se på nogle nedstrøms applikationer og variationer af denne meget nyttige metode.
her ser du et agarosegelelektroforeseresultat efter adskillelse af PCR-produkter. DNA-fragmenterne, der er indlæst i gelen, er synlige som klart definerede bånd. DNA-standarden eller stigen skal adskilles i en grad, der muliggør nyttig bestemmelse af størrelserne på prøvebånd. I dette eksempel adskilles DNA-fragmenter af 765 basepar, 880 basepar og 1022 basepar på en 1,5% agarosegel med en 2-log DNA-stige.
ud over at bekræfte tilstedeværelsen af et DNA-fragment af interesse kan DNA-gelelektroforese kombineres med gelrensningsprocedurer. Typisk bruges et barberblad til at skære DNA-fragmentet af interesse ud, så det kan opsamles og DNA-prøven i det genvindes.
agarosegelelektrofese kan også kombineres med overførselsblotting, hvilket indebærer at tillade DNA eller RNA at overføre til en cellulosemembran, hvor radioaktive prober kan bruges til at identificere specifikke DNA-eller RNA-sekvenser i din elektroforetisk adskilte prøve.
standard DNA-gelelektroforese er ikke ideel til adskillelse af DNA med høj molekylvægt større end 15-20 kb i størrelse, som genomisk DNA. For at adskille store DNA-prøver anvendes pulsfeltgelelektroforese, hvilket indebærer at udsætte gelen for et skiftende eller pulserende elektrisk felt i forskellige retninger. Denne teknik involverer et specialiseret gelkøreapparat, som har par elektroder anbragt i forskellige retninger omkring gelen. Dette kan bruges til at detektere forskelle i genomstørrelser mellem populationer af organismer, som de samlede DNA-prøver fra forskellige mikrobielle samfund, du ser her, som er taget fra forskellige sømiljøer.
du har lige set en introduktion til DNA gel elektroforese. Vi viste dig konceptet bag metoden, hvordan man forbereder agarosegelen, hvordan man indlæser dine prøver, hvordan man kører gelen og analyserer den og nogle almindelige anvendelser af agarosegelelektroforese. Tak for at se og held og lykke med at køre din gel.