materialer og metoder
dupleks DNA-forberedelse. For at fremstille 30-bp dupleks DNA-molekyler blev to oligonukleotider med følgende sekvens og modifikationer hybridiseret (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotid 5 ‘- GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ blev mærket med Cy5 ved sin 5’ ende og med Cy3 ved sin 3 ‘ ende. Det komplementære oligonukleotid blev mærket med biotin i begge ender.
proteinekspression og oprensning. Det gule fluorescerende protein (YFP) gen i p2bac / pFastBac-YFP-M5-CaM plasmid (en gave fra H. Lee Sveney, University of Pennsylvania, Philadelphia) blev slettet af PCR. Den resulterende p2bac / pFastBac-M5-CaM plasmid koder for kylling myosin V, der er afkortet ved Glu-1099. En leucin lynlås fulgte den oprindelige oprullede spole for at sikre dimerisering. For at lette oprensningen blev myosin V-proteinet n-terminalt mærket med et FLAG-tag (DYKDDDDK). To rekombinante baculovirus blev genereret til proteinekspression i SF9-celler. Den ene kodede det trunkerede myosin V og Drosophila melanogaster calmodulin afledt af p2bac/pFastBac-M5-CaM plasmidet. Den anden virus kodede den humane essentielle lette kæde afledt af p2bac/pFastBac-ELC-plasmidet. Begge vira blev brugt til coinfektion af SF9-celler. Proteinet blev udtrykt og oprenset som beskrevet af Svend et al. (20).
Calmodulin mærkning og udveksling. Calmodulin blev udtrykt og mærket med Cy3 eller Cy5 som følger: en enkelt cystein blev introduceret i havpindsvin calmodulin ved hjælp af mutationen 143C. Denne calmodulin blev udtrykt i Escherichia coli og oprenset som beskrevet i ref. 21. Calmodulin blev mærket med enten Cy3-maleimid eller Cy5-maleimid (Amersham Biosciences) stamopløsninger (i DMSO) ved et 1,4 gange molforhold i 20 minutter. Overskydende farvestof blev fjernet ved gelfiltrering til udvekslingsbuffer (nedenfor) efterfulgt af hydrofob absorption natten over på BioBeads (Bio-Rad). Label inkorporering var 102% for Cy3-calmodulin og 75% for Cy5-calmodulin. Alikvoter blev opbevaret ved -80 kr.
udvekslingen af mærket calmodulin på myosin V blev udført som beskrevet, men med nogle ændringer (22). Myosin V (150 nM) blev inkuberet med 0,7 nM Cy3-mærket calmodulin og 0,8 nM Cy5-mærket calmodulin i udvekslingsbuffer (25 mM KCl/20 mM HCI, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) ved 22 liter C i 2 min. Til udveksling af calmoduliner blev der tilsat 0,9 mM CaCl2, og blandingen blev inkuberet ved 22 liter C i 5 minutter. Reaktionen blev slukket med 7 mM EGTA. Reaktionsblandingen blev påført på en 100k Nanocep ultrafiltreringsanordning (Pall) og vasket tre gange med lige store mængder AB (nedenfor) for at rense myosin V fra overskydende calmodulin.
Forberedelse Af Strømningsceller. Strømningscellen blev konstrueret med et glasmikroskopglas og stærkt brydende dækglas lavet af nlaf21 (va Optical Labs, San Anselmo, CA) holdt sammen af stykker dobbeltsidet Scotch tape.
til myosin V-eksperimenterne blev 15 liter biotin-BSA (1 mg·ml-1) inkuberet i strømningscellen i 2 minutter, hvorefter 30 liter AB-buffer (25 mM KCl/25 mM HCI, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) blev ført gennem strømningscellen for at vaske den ud. Femten mikroliter på 0,5 mg/ml NeutrAvidin (molekylære prober) blev tilsat til cellen og fik lov til at inkubere i 2 minutter, hvorefter en anden vask blev udført med AB-buffer. Strømningscellen blev inkuberet med 15 liter biotinylerede phalloidin actinfilamenter (250 nM) i 5 minutter efterfulgt af en 100-liter vask med AB-buffer. Endelig blev cellen lastet med 20 liter billeddannelsesbuffer inklusive calmodulin-udvekslet myosin V, 5 liter calmodulin, 300 nM ATP, et ATP-regenereringssystem (0,1 mg·ml-1 kreatinphosphokinase/1 mM kreatinphosphat) og 0,5% (vol/vol) Triton-100 for at reducere uspecifik binding. Cellen blev forseglet med vakuumfedt og afbildet straks. Den endelige motorkoncentration resulterede i tyndt dekoreret actin og tillod således en analyse af enkelte myosin V-molekyler.
til DNA-eksperimenterne blev biotin-BSA og NeutrAvidin indlæst på samme måde som for myosin V-eksperimenterne, men vaskene blev udført med T50-buffer (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Når strømningscellen havde en Neutravidincoating, blev 15 liter dsDNA (30 nM) i T50-buffer med 1 mg·ml-1 BSA strømmet ind og inkuberet i 2 minutter, hvorefter 100 liter billeddannelsesbuffer blev strømmet ind. Strømningscellen blev derefter forseglet med vakuumfedt og straks afbildet. Den resulterende dekoration af DNA-molekyler på overfladen var tilstrækkelig sparsom til, at fluorescerende pletter fra forskellige molekyler sjældent overlappede.
Opsætning Af Mikroskop. Total intern reflection fluorescence (TIRF) mikroskop blev oprettet som beskrevet i ref. 8, med nogle modifikationer (Fig. 5, som offentliggøres som understøttende information på PNAS ‘ hjemmeside). Eksitationskildestråler ved 532 nm (sammenhængende, Santa Clara, CA) og 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) blev kombineret med et dikroisk spejl og udvidet til en diameter på 7 mm. Disse kilder var fokuseret (brændvidde = 500 mm) på det bageste fokusplan for et Olympus 1.65 NA kur 100 TIRF-mål ved hjælp af en laserlinjedichroisk på et lineært translationstrin, der tillader mikroskopoperation i enten epifluorescens eller TIRF-tilstande. Målet blev placeret under et lukket kredsløb, toakset, nanotransleringstrin udstyret med kapacitive sensorer til positionsmåling (Physik Instrumente, Auburn, MA). Det reflekterede lys, der forlader objektivets bagåbning, blev rettet mod en kvadrantfotodiode for at give et signal til en fokus feedback loop, der fastspændte afstanden mellem målet og prøven med en elektrostriktiv aktuator (Nyport, Fountain Valley, CA). Fluorescensemission blev opsamlet af målet, passeret gennem to stopline tynde filmhakfiltre (Semrock, Rochester, NY), En for hver eksitationskilde og transmitteret gennem et dobbeltvisningsapparat, der tillod samtidig billeddannelse af Cy3-og Cy5-kanalerne på et enkelt ikson DV 887 EMCCD-kamera (Andor Technology, Belfast, Irland). Alle data blev afbildet med en 0,5 sek integrationstid. Krydstale mellem de to kanaler (10%) formentlig fordrejer afstandsmålingerne mod mindre værdier. Vores eksperimentelle fejl gør det imidlertid uopdageligt, som vist ved Monte Carlo-simuleringer, hvor 100 par modellerede billeder af enkeltfluorophorer adskilt med 10 nm blev oprettet og analyseret identisk som med DNA-dataene (beskrevet nedenfor). Simulerede billeder af fluorescerende punktspredningsfunktioner blev beregnet ved at generere en integreret 2D Gaussisk intensitetsfordeling med en konstant baggrund, hvortil skudstøj blev tilføjet. De simulerede toppe havde de samme dimensioner og signal-til-støj-forhold som de virkelige toppe. Simulerede data med 10% krydstale og simulerede data uden krydstale kan ikke skelnes ved en Kolmogorov-Smirnov-test (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Dataanalyse. En registreringskortlægning af Cy3-og Cy5-kanalerne blev udført med fiducials bestående af 100 nm Transfluosfæreperler (molekylære prober). De var begejstrede ved 532 nm, og de udsender med et bredt emissionsspektrum. Perlen var detekterbar i begge vores kanaler. Vi fandt en enkelt perle, der var forbundet med dækglasset, og med vores pieso-fase trådte vi den med nanometerpræcision i et gittermønster (med en afstand på 0,5 liter) og tog et billede ved hvert stop. Slutresultatet var en stak på 312 billeder, der viser perlen i begge kanaler i forskellige positioner (Fig. 1a).
DNA-dataene blev analyseret ved hjælp af hjemmelavet program ved hjælp af matlab (Matlab, Natick, MA). Rutinen lokaliserer automatisk toppe i billedet ved at bestemme billedpunkterne med høj intensitet og sikrer, at de omgivende billedpunkter har intensiteter som forventet for en enkelt fluorofor. Før montering af toppe til en 2D Gaussisk funktion for at få sine centerplaceringer, vi søger efter par toppe. De billedpunkter, der findes i Cy5-kanalen, kortlægges på Cy3-kanalen, og der udføres en søgning efter toppe i de omkringliggende Cy3-billedpunkter. Hvis der findes en top, betragtes Cy5-toppen og Cy3-toppen som et par til yderligere analyse. Hver top er egnet til en 2D Gaussisk funktion i sit respektive rum som beskrevet for perlerne ovenfor. 1 ). Fejlen på fit-middelplaceringen beregnes med antallet af indsamlede fotoner (Ny), 
Cy5 ‘ s placering er kortlagt til Cy3-kanalen, og afstanden mellem dem beregnes. Efter beregningsanalysen af DNA-dataene blev de identificerede fluoroforpar screenet manuelt for at sikre, at parene ikke var tæt på andre fluoroforer, der ville have forstyrret parernes analyse.
myosin V-dataene blev analyseret ved først at identificere en bevægelig motor med øjet. Hjemmelavet program skrevet i matlab passer derefter startparet af fluorescerende toppe til 2D gaussiske funktioner som beskrevet ovenfor og fortsatte med at spore toppe så længe brugeren specificerede. Motorer, hvis konjugerede farvestoffer hver fotobleget i et enkelt trin blev analyseret, som det var tilfældet for de fleste af de observerede motorer, hvilket sikrede, at vi faktisk studerede motorer med kun en Cy3-etiket og en Cy5-etiket. De resulterende baner blev registreret ved at kortlægge Cy5-banen på Cy3-kanalen. En mindste kvadraters lineær tilpasning til punkterne fra begge baner gav orienteringen af actinfilamentet, hvortil banerne blev projiceret. Afstande langs den lineære pasform (actinfilamentet) blev afbildet mod tiden for at se hovedernes relative afstande (Fig. 4).
tidsspor af et differentielt mærket myosin V-molekyle, der går langs en actinfilament. Etiketterne (Cy3 og Cy5) er kovalent bundet til calmoduliner, der blev udvekslet på myosin V-molekylet. I dette spor tager begge fluorescerende probes placeringer 72 nm trin, hvilket indikerer, at calmodulinerne blev udvekslet tæt på motordomænet. Sondernes skiftende positioner giver en direkte observation af myosin V ‘ s hånd-over-hånd-gangmekanisme.