Oncology Reports

introduktion

lungekræft er en malign tumor med den højestemorbiditet og dødelighed over hele verden, og dens forekomst er påstigning. 80% af sygdommen kan tilskrivesikke-småcellet lungekræft (NSCLC) (1). På grund af begrænsningerne af tidligtdiagnostiske teknikker og manglen på tidlige specifikke kliniskemanifestationer, 70-80% af patienterne diagnosticeres i avancerede stadier(2). Derfor er identifikation af asafe og effektiv lægemiddelbehandling for NSCLC afgørende.

nylige fund har vist,at forekomsten, udviklingen og overførslen af NSCLC ikke kun påvirkes afgenetiske faktorer,men at epigenetisk ændring også er vigtig, herunder lille molekyle ikke-kodende RNA (ncRNA) (3). MicroRNA(miRNA), en klasse af endogenlille ncRNA med en længde på ~21-25 baser, bredt eksisterende ineukaryoter, kan identificere mRNA ‘ et for et specifikt målgen (4). Over 50% af miRNA-generne kortlægges i NSCLC-relaterede skrøbelige steder eller genomiske regioner,hvilket antyder, at miRNA-ekspression kan være tæt forbundet mednsclc. Som rapporteret viser ekspressionen af et stort antal miRNA ‘er inNSCLC lidelse og ubalancen af miRNA’ er fremme progression af NSCLC-cellecyklus, anti-apoptotisk virkning, forbedret celle invasion og metastase af ikke-småcellet lungekræft(5).

PI3K/Akt signalvejen spiller en vigtigrolle i vækstfaktor-medieret celleoverlevelse. Tidligere fundhar vist, at forstyrrelsen i PI3K/Akt/mTOR-stien kan spilleen vigtig rolle i dannelsen af NSCLC (6). Det er også blevet rapporteret, at celleproliferationssignalet genereret ved kombinationen af et antal transmembranreceptorer og ligander kan aktivere signaltransduktion af PI3K/Akt/mTOR, som er tæt forbundet mednsclc-proliferation og overlevelsesstatus (7). Disse receptorer inkluderer C-met,epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR), c-kit og insulinlignende vækstfaktorreceptor (IGF-IR).

Curcumin er en naturlig aktiv ingrediens ekstraheret fra tør jordstængler af Gurkemeje Curcuma slægten plante, gurkemeje ogcurcuma, med omfattende farmakologiske virkninger, lav toksicitet oggod tolerance, og på grund af sin økonomiske værdi er det blevet et hotspot til efterforskning (8). Undersøgelser med fokus på curcumin har identificeret en bred vifte af farmakologiske aktiviteter såsom anti-inflammation,antioksidering, lipid, anti-virus, anti-infektion, anticancer,antikoagulant, anti-lever fibrose og aterosklerose, lavtoksicitet og få bivirkninger (9-13).Effekten af curcumin på NSCLC og den underliggendemolekylær mekanisme forbliver uklar. I denne undersøgelse undersøgte vi curcumins anticancereffekt på celleproliferation og apoptose af human NSCLC og identificerede et muligt forhold mellem denne effekt og miRNA-192-5p-moduleret PI3K/Aktsignaleringsvej.

materialer og metoder

kemikalier

dulbeccos modificerede Eagle ‘ s medium (DMEM) og fetalcalf serum (FBS) blev købt fra Gibco (Carlsbad, CA, USA) og(Sydamerika). 3-(4,5-Dimethyl-2-yl)-2,5 diphenyltetrasoliumbromid (MTT) blev købt fra Sangon Biotech(Shanghai, Kina). Apoptose Detection kit jeg blev købt frabd Biosciences (San Jose, CA, USA). Caspase – 3 activity assaykit blev købt fra Promega (Madison, USA).

cellekultur

Human normal NCL-H460 og BEAS-2e lungepitelceller og humane a549 lungecancerceller blev opnået fra CellResource Center på det andet militære medicinske universitet. Disse celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS (begge fromGibco), 100 E/ml penicillin og 100 liter/ml streptomycin at37 liter C og en humidifid inkubator med 5% CO2. Koncentrationerne (5,10,20 og 40 liter) og tidsperioderne (12 og 24 timer) af curcumin mod a549-celler blev undersøgt. Den kemiske struktur af curcumin er vist i Fig.1.

analyse af cellelevedygtighed

celler blev podet med en densitet på5 liter 103/brønd i 96-brøndsplader. Kort sagt, celleviabilitetblev målt ved MTT-analyse (Sangon Biotech). Ti mikroliter MTT (5 mg/l) blev tilsat i hver brønd og inkuberet i 4 timer ved 37 liter C i ahumidificeret inkubator med 5% CO2. Dimethylsulfoksid (150; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) blev tilsat til hver brønd og omrørt i 20 minutter ved rumtemperatur. Absorbansen blev målt ved 450 nM ved anvendelse af amicroplate reader.

bilag V-FITC/propidiumiodid (PI)apoptoseanalyse

celler blev podet med en massefylde på1 liter 106/brønd i 6-brøndsplader. Dyrkede celler blev vasket to gange med iskold PBS og derefter farvet med bilag V-FITC og PIusing apoptose Detection kit i ifølge producentens instruktioner (BD Biosciences). Apoptose blev analyseret via strømningscytometrisk ved hjælp af IVD-programmer (begge fra BDBiosciences).

caspase-3 aktiveringsanalyse

celler blev podet med en massefylde på 5 liter 103/brønd i 96-brøndsplader. Caspase – 3-aktiviteten blev målt ved hjælp af et caspase-3-aktivitetsanalysesæt i henhold til producentens anvisninger (Promega). Et hundrede mikroliterreaktionsbuffer med 10 liter-substrat Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroanilin (pNA) blev tilsat til 10 liter proteincellelysat/brønd og inkuberet ved 37 liter C i 6 timer. Caspase-3-aktivitetblev analyseret ved en absorbans på 405 nm.

Celletransfektion

miR-192-5p, anti-miR-192-5p og negativ kontrolmimics (miR-NC) blev alle købt fra Sangon Biotech. Cellerneblev podet i 6-brønds plader og vokset til 50-60% sammenløb priorto transfektion. Efterligningerne blev transficeret med Lipofectamin2000 til celler i henhold til producentens anvisninger(Invitrogen Life Technologies). Gen eller protein blev isoleret 24 hafter transfektion og anvendt til henholdsvis revers transkription-kvantitativpolymerasekædereaktion (RT-kpcr) eller vestlig blot-analyse.

RT-kpcr

celler blev podet med en massefylde på5 liter 103/brønd i 96-brøndsplader. Total RNA blev ekstraheretfra cellerne ved hjælp af Trisol reagens (Invitrogen Life Technologies).Koncentrations-RNA ‘ et blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop krist nd-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc.,De, USA). Kvantificering af miRNA ‘ erne blev udført afet takman miRNA assay kit (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA). Total RNA blev underkastet første streng cDNA-syntese ogundersøgt ved anvendelse af et PrimeScript RT reagens kit (begge fra Takara,Shiga, Japan). PCR-Masterblanding (Takara)på ABI 7500ht-systemet. De primere, der anvendes i reaktionerne, er vist i tabel I.

tabel i de PCR-primere, der anvendes itreaktionerne.

vestlig blot-analyse

celler blev podet med en densitet på5 liter 103/brønd i 96-brøndsplader. Dyrkede celler blev vasketto gange med iskold PBS og inkuberet med iskold lysis Bufferi 30 minutter på is. Cellevæske blev opsamlet og centrifugeret ved 12.000 liter g i 10 minutter ved 4 liter C. Den opløselige proteinkoncentration varbestemt ved anvendelse af et BCA-proteinassay kit (Sigma, St. Louis, MO,USA). Total proteiner (10 liter) blev kørt på 12% natriumdodecylsulfat (SDS)-polyacrylamidgeler og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Membranerne blev blokeret med trisbufret saltvand (TBS) indeholdende 5% fedtfri mælk til blokeringikke-specifikke bindingssteder. Membranerne blev inkuberet medanti-PI3K (1:1.500) og anti-Akt (1: 1000).(1: 500;Sangon Biotech) natten over ved 4. Efter at være blevet vasket med 1% mellem-20/PBS blev membranerne inkuberet med sekundærantistoffer (Tiangen, Beijing, Kina) i 2 timer ved stuetemperatur.Proteinerne blev påvist ved anvendelse af forbedret kemiluminescens(Vilber, Marne La Vall Kurte, Frankrig).

statistisk analyse

statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 19.0-programmer. Resultaterne præsenteres som middelkr. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af den studerendes t-test eller envejsanalyse af varians(ANOVA). P< 0, 05 blev betragtet som statistisk signifikant.

resultater

Curcumin hæmmer levedygtigheden af a549celler

koncentrationerne (5, 10, 20 og 40 liter) og tidsperioder (12, 24 eller 36 timer) af curcumin mod a549 celler blev vurderet ved hjælp af MTT-analysen. Fig.2 viser, at behandlingen af a549 – celler for 12, 24 eller 48 h med 10, 20 og 40 curcumin hæmmede cellelevedygtigheden på adose-og tidsafhængig måde. MTT-analysen viste, atcurcumin(20 og 40 liter) behandling i 24 eller 36 timer resulterede i ubetydelig cellelevedygtighed sammenlignet med kontrolgruppen (Fig. 2).

Curcumin inducerer apoptose af A549celler

før behandlingen blev den apoptotiske hastighed afcurcuminbehandlede (10, 20 eller 40 liter) a549 celler også målt. Efter behandling med 20 eller 40 curcumin til 24 timer steg den apoptotiske hastighed markant i en dosisafhængigmanner sammenlignet med kontrolgruppen (Fig. 3).

Curcumin inducerer caspase-3-aktivitet afa549 celler

for at bestemme, om curcumin inducerer caspase-3-aktivitet af a549-celler, blev caspase-3-aktivitet målt ved hjælp af acaspase-3-aktivitetsassay kit. Caspase-3-aktivitet steg ogsåvæsentligt på en dosisafhængig måde efter curcumin (20 eller 40 liter) behandling i 24 timer sammenlignet med kontrolgruppen(Fig. 4). Disse resultater indikeredeat curcumin inducerede apoptose i a549 celler.

miR-192-5p hæmmer cellelevedygtighed oginducerer apoptose af a549 celler

for at undersøge ekspressionen og betydningen afmir-192-5p i humane normale lungepitel-og lungecancerceller blev den relative ekspression mir-192-5p påvist ved anvendelse af RT-kpcr.Fig. 5A viser, at mir-192-5prelativ ekspression af NCL-H460-celler var relativt lavere, den afa549-celler var højere, hvor BEAS-2e-celler var de mest udtalt.

for at analysere, om miR-192-5p påvirkede cellevibilitet og apoptose af a549-celler, transficerede vi miR-192-5pmimics til a549-celler. Cellerne transficeret med miR-192-5pmimics viste en signifikant, 120 gange stigning i Mir-192-5pekspression efter 48 h transfektion sammenlignet med kontrol ormiR-NC-gruppen (Fig. 5B).Overekspression af miR-192-5p reducerede levedygtigheden af a549-celler sammenlignet med kontrol-eller mir-NC-gruppen (Fig. 5C). Imidlertid inducerede overekspression afmir-192-5p den apoptotiske hastighed for a549-celler sammenlignet med kontrol-eller mir-NC-gruppen (Fig.5D).

inhibering af miR-192-5p undertrykker cellevibilitet og inducerer apoptose af a549-celler

for at bestemme, om anti-mir-192-5p påvirkede cellens levedygtighed og apoptose af a549-celler, transficerede vianti-mir-192-5p efterligner i a549-celler. Ekspressionsniveauet afmir-192-5p blev detekteret ved anvendelse af RT-kpcr efter 48 h transfektion.Anti-miR-192-5p-efterligninger undertrykte effektivt mir-192-5prelativ ekspression af a549-celler (Fig.6A). Nedregulering af miR-192-5p fremmede cellelevedygtighed og hæmmede den apoptotiske hastighed for henholdsvis a549-celler sammenlignet med kontrol-eller mir-NC-gruppen (Fig.6B og C).

Curcumin hæmmer mir-192-5p-genekspression af a549-celler

for at bestemme, om curcumin påvirkede mir-192-5pgenekspression af a549-celler, blev ekspressionsniveauet for miR-192-5p påvist ved anvendelse af RT-kpcr efter behandling med curcumin i 24 timer. Fig. 7 viser, at udtryketniveauet af miR-192-5p blev markant forbedret af curcumin (20 eller 40 liter).

miR-192-5p hæmmer virkningen af curcumin på cellelevedygtighed og inducerer apoptose af a549 celler

for at undersøge, hvordan overekspression af miR-192-5p påvirkede effekten af curcumin på cellelevedygtighed og denapoptotiske hastighed af a549 celler, transficerede vi miR-192-5p efterligner ia549 celler. Fig. 8 viser, at curcumin undertrykte cellelevedygtigheden og øgede den apoptotiske rate af a549-celler efter behandling med curcumin (20 liter) for henholdsvis 24 timer sammenlignet med kontrolgruppen. Effekten afcurcumin(20 liter) på cellelevedygtigheden og den apoptotiske hastighed af a549 celler blev markant reduceret og øget med henholdsvis mir-192-5pmimics sammenlignet med den curcumin-behandlede gruppe (Fig. 8A).

inhibering af miR-192-5p undertrykker effekten af curcumin på cellelevedygtighed og inducerer apoptose af A549celler

for at undersøge, hvordan nedreguleringen af miR-192-5P påvirkede effekten af curcumin på cellelevedygtighed og denapoptotiske hastighed af a549 celler, transficerede vi anti-mir-192-5p efterligningertil A549 celler . Fig. 9 viser, at curcumin undertrykte cellelevedygtigheden og øgede den apoptotiske rate af a549-celler efter behandling med curcumin (20 liter) for henholdsvis 24 timer sammenlignet med kontrolgruppen. Imidlertid blev effekten af curcumin (20 liter) på cellelevedygtighed og denapoptotiske hastighed af a549-celler markant forøget og reduceret med henholdsvis anti-miR-192-5p-efterligninger sammenlignet med den curcumin-behandlede gruppe (Fig.9A).

Curcumin hæmmer PI3K/Akt-proteinekspression af a549-celler

for at afgøre, om curcumin påvirkede PI3K/Aktproteinekspressionen af a549-celler, blev PI3K/Akt-proteinekspressionen påvist ved anvendelse af vestlig blot-analyse efter behandling medcurcumin i 24 timer. Fig. 10 viser, at PI3K / Akt-proteinekspression blev markant forbedret afcurcumin (20 eller 40 liter).

miR-192-5p målretter direkte mod PI3K/Akt ofA549 celler

for at undersøge, hvordan overekspression af miR-192-5p påvirkede PI3K/Akt-proteinekspression af a549 celler, vitransfekterede miR-192-5p efterligner til a549 celler. Fig. 11A og B viser, at curcuminundertrykkede PI3K / Akt-proteinekspressionerne af a549-celler efter behandling med curcumin (20 liter) i 24 timer sammenlignet med kontrolgruppen. Effekten af curcumin(20 liter) på PI3K/Akt-proteinekspression af a549-celler blev åbenbart reduceret medmir-192-5p-efterligninger sammenlignet med den curcumin-behandlede gruppe (Fig. 11C og D).

inhibering af miR-192-5p øger PI3K/Akt-ekspression af a549-celler

for at bestemme, om anti-mir-192-5p påvirkede curcumins virkning på PI3K/Akt-proteinekspression af a549-celler, vioverført anti-miR-192-5p efterligner til a549-celler. Fig. 12A og B viser, at curcuminundertrykkede PI3K / Akt-proteinekspression af a549-celler efter behandling med curcumin (20 liter) i henholdsvis 24 timer sammenlignet med kontrolgruppen. Imidlertid blev effekten af curcumin (20 liter) på PI3K/Akt-proteinekspression af a549-celler markant forbedret af henholdsvis anti-mir-192-5p-efterligninger sammenlignet med den curcumin-behandlede gruppe (Fig.12C og D).

Diskussion

en million patienter bukker under for NSCLC årligtover hele verden, og forekomsten af NSCLC er gradvist stigende.Selvom en række undersøgelser i de senere år har fokuseret på NSCLC,er der ikke gjort store fremskridt med hensyn til behandling. Operationforbliver den mest effektive behandlingsmetode, men med hensyn tilforebyggelse såvel som for patogenesen af NSCLC yderligere undersøgelserskal udføres (14,15). For nylig, Liu et al identificeretat curcumin hæmmer proliferation og inducerer signifikant celle apoptotisk hastighed af gastrisk cancerceller (16). Ma et al viste detcurcumin hæmmer cellevækst og invasion af bugspytkirtelkræftceller (17). Samlet viste ourfindings, at curcumin undertrykte cellelevedygtighed, inducerede celle apoptose og øgede caspase-3-aktiviteten af a549-celler.Derfor er curcumin et potentielt lægemiddel til onkoterapi.

miRNA er en klasse af lille molekyle RNA, som har en meget vigtig rolle i genekspressionsregulering som for nyligidentificeret (18). miRNA gener ernormalt placeret i intron segmenter af Gen. Imidlertid er miRNA ‘ er også fordelt uden for ikke-kodende eksoner af genet ogintergen region, som har vist sig at deltage i en række kendte onc-ogeniske veje, såsom p53, Bcl-2 og K-Ras(19). Det har vist sig, at> 50% af definerede humane miRNA ‘ er er placeret i genomets skrøbelige steder, og disse skrøbelige steder er ofte forbundet med forekomsten af NSCLC (20). Mirna ‘ ernes ekspressionsprofiler er forbundet med udviklingen af NSCLC. mir-34C, miR-145 og miR-142 kan hæmme NSCLC (5). Resultaterne af den foreliggende undersøgelse indikerer, at mir-192-5p relativ ekspression af NCL-H460-celler varrelativt lav, den af a549-celler var højere, hvor BEAS-2e-celler var den mest udtrykte. Overekspression af miR-192-5p mindskede cellens levedygtighed og øgede den apoptotiske hastighed af a549 celler. Nedregulering af miR-192-5p øgede cellenlevedygtighed og reducerede apoptotisk hastighed af a549 celler.Derudover hæmmede curcumin mir-192-5p genekspression af a549celler. Opreguleringen af Mir-192-5p-ekspression forbedredeeffekten af curcumin på cellelevedygtighed og den apoptotiske hastighed afa549-celler, mens nedreguleringen af Mir-192-5p-udtryk reverserede effekten af curcumin på a549-celler. Vores resultater var i overensstemmelse med resultaterne fra andre undersøgelser. For eksempel rapporterede Ye etal, at curcumin fremmer celleapoptose ved at aktiveremir-192-5p (21). De sandsynlige mekanismer for, hvordan curcumin påvirker mir-192-5p-ekspression, er imidlertid uklare, og fremtidige undersøgelser for at bestemme denne effekt bør udføres.

i de senere år har effekten af PI3K/Aktsignaleringsvejen på human NSCLC fået stor opmærksomhed(22). Aktivering af PI3K / Aktsignaleringsvejen er meget almindelig i human NSCLC, som kan fremmeforekomsten af kræft gennem en række mekanismer, herundergenmutationer, reduktion af kræftundertrykkende Gen Ptenekspression, PI3K-mutation eller amplifikation, Akt-mutation elleramplificering og onkogenreceptoraktivering (7). Aktivering af hver komponent i denne sti er hovedårsagen til den ugunstige prognose for NSCLC,som kan føre til lægemiddelresistens i behandlingen, og hæmning af denne vej kan således vende lægemiddelresistens og forbedrekemoterapi og strålingseffekter in vivo (23). De data, der blev opnået i nærværende undersøgelse, viste, at curcumin undertrykte PI3K/Akt-proteinekspression af a549-celler. Opregulering af Mir-192-5p-ekspressionafraineret PI3K/Akt-proteinekspression af a549-celler.Nedregulering af Mir-192-5p-ekspression kan øge PI3K/Aktproteinekspression af a549-celler. Curcumin hæmmer invasionen og migrationen af ftc133 cellvia nedregulering af PI3K/Akt signalvejen i thyroidcancerceller (24). Curcumin hæmmer tumorproliferation af lungekræftgennem PI3K / Akt-vejen (25).Schee et al afslørede, at miR-22-3p, miR-143-3p ogmir-192-5p regulerede og var involveret i APC, TGF-Karrus og Pi3kvej i kolorektale cancerceller (26).

afslutningsvis fokuserede denne undersøgelse på effekten afcurcumin mod a549 celler, hæmmet celleproliferation oginduceret apoptose af human NSCLC gennem opregulering afmir-192-5p og undertrykkelse af PI3K/Akt signalvejen. Konklusionerne fra denne undersøgelse indikerer, at curcumin er apotentielt mål i behandlingen af NSCLC. Imidlertid afslørede denne undersøgelse nogle begrænsninger, da vi ikke undersøgte det detaljerede forhold mellem miR-192-5p og PI3K/Akt-vejen i lungekræftceller. Yderligere undersøgelser in vivo, kliniske ogstørre statistiske analyser af den foreliggende undersøgelse skal udføres for at verificere resultaterne.