Poisson-distribution, opkaldt efter den franske matematiker Sim Porton Denis Poisson, er sandsynligheden for forekomst af et givet antal begivenheder i en given (fast) tidsperiode, hvis begivenhederne forekommer med en konstant hastighed (kendt) og er uafhængige af forekomsten af den foregående begivenhed. Det er baseret på en diskret sandsynlighedsfordeling, hvor sæt af resultater er diskrete eller endelige, såsom kast af en mønt eller terningkast.
i forbindelse med et digitalt PCR-eksperiment er de diskrete resultater tilstedeværelsen eller fraværet af målgenet. De tusinder af individuelle partitioner, der produceres til en digital PCR-reaktion, forventes at følge en Poisson-fordeling i betragtning af, at partitionerne er monodisperserede, og de indeholder det ækvivalente volumen af prøveblandingen.
hvis disse parametre ikke er opfyldt, og partitionerne udviser polydispersitet, vil volumenet af prøveblanding i partitionerne variere stort set, og de større partitioner kan indeholde flere mål end de mindre, hvilket sænker præcisionen af den digitale PCR-reaktion.
i dette punkt leder vi dig gennem den matematiske beregning af Poisson-loven til et digitalt PCR-eksperiment.
for et digitalt PCR-eksperiment, en brønd, der indeholder den partitionerede prøve af interesse, og et målgen, der skal kvantificeres, skal vi først definere følgende variabler:
- \(N\): samlet antal analyserbare partitioner i brønden
- \(p\): antal positive partitioner for målgenet
- \(v\): volumen af partitionen (i pristl), antages at være konstant
- \(d\): fortyndingsfaktor, der bruges til at fortynde prøven fra bestanden til brønden
( \(d=10\) betyder, at prøven er blevet fortyndet 10 gange)
og derefter disse yderligere:
-
\(V = N \ v\): samlet partitionsvolumen injiceret i brønden
-
\(C_{0}\) : koncentration af målgener i brønden(i kopier / prisl)
-
\(C = d \ C_{0}\): koncentration af målgener i bestanden (i kopier / prisl)
-
\(\lambda = C_{0} \ v\): gennemsnitligt antal målgener pr. partition i brønden
fordelingen af målgenerne indkapslet i partitionerne af brønden følger en Poisson-fordeling af parameter \(\lambda\):
Proba ( partition indkapsler \(\tekst{$k$}\) målgener) \ (=\dfrac{\lambda^k}{k!} e^{- \lambda}\)
en partition siges:
-
“positiv partition” hvis den har indkapslet mindst 1 målgen (i hvilket tilfælde vi vil observere en fluorescerende partition ved slutpunktet af amplifikationsprocessen, så det meste af usikkerheden ligger i denne “mindst en” tilstand)
-
“negativ partition” if har indkapslet 0 målgen (i hvilket tilfælde vil vi observere en ikke-fluorescerende partition ved slutpunktet af amplifikationsprocessen)
fordelingen af positive partitioner i brønden følger en binomial fordeling af sandsynlighed \(1 – e^{- \lambda}\):
- Sandsynlighed (godt indeholder \(\tekst{$p$}\) positive partitioner \(= {\rm C}_{N}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- Sandsynlighed (partition er negativ) \( = e^{-\lambda} \)
- Sandsynlighed (partition er positiv) \( = 1 – e^{-\Lambda} \)
hvis \(N\) er stor nok:
- Proba (partitionen er positiv) \ (=\dfrac{p}{N} \)
så formlen for den estimerede bestandskoncentration er:
\ (C = – \ dfrac{d}{v} \ ln {\venstre (1- \ dfrac{p}{N} \ højre)} \)
hvis du automatisk har brug for at beregne estimerede koncentrationer af målgener, sammen med deres konfidensinterval og relative usikkerhed, et online værktøj er tilgængeligt: Poisson lov: går videre. Prøv det!
For mere information om usikkerhedskurverne samt grænserne for detektion og kvantificering, se venligst punktet: dynamiske Detekteringsområder & kvantificering.