Die Poisson-Verteilung, benannt nach dem französischen Mathematiker Siméon Denis Poisson, ist die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer bestimmten Anzahl von Ereignissen in einem bestimmten (festen) Zeitraum, wenn die Ereignisse mit einer konstanten Rate (bekannt) auftreten und unabhängig vom Auftreten des vorherigen Ereignisses sind. Es basiert auf einer diskreten Wahrscheinlichkeitsverteilung, bei der die Ergebnisse diskret oder endlich sind, z. B. der Wurf einer Münze oder ein Würfelwurf.
Im Rahmen eines digitalen PCR-Experiments sind die diskreten Ergebnisse die Anwesenheit oder Abwesenheit des Zielgens. Es wird erwartet, dass die Tausenden von einzelnen Partitionen, die für eine digitale PCR-Reaktion hergestellt werden, einer Poisson-Verteilung folgen, wenn man bedenkt, dass die Partitionen monodispers sind und das äquivalente Volumen der Probenmischung enthalten.
Wenn diese Parameter nicht erfüllt sind und die Partitionen Polydispersität aufweisen, variiert das Volumen der Probenmischung in den Partitionen stark und die größeren Partitionen können mehr Targets enthalten als die kleineren, was die Präzision der digitalen PCR-Reaktion verringert.
In diesem Artikel führen wir Sie durch die mathematische Berechnung des Poisson-Gesetzes für ein digitales PCR-Experiment.
Für ein digitales PCR-Experiment, eine Vertiefung, die die partitionierte Probe von Interesse enthält, und ein Zielgen zur Quantifizierung müssen wir zuerst die folgenden Variablen definieren:
- \( N\): Gesamtzahl der analysierbaren Partitionen im Well
- \(p\): Anzahl der positiven Partitionen für das Zielgen
- \(v\): Volumen der Partition (in µL), als konstant angenommen
- \(d\): Verdünnungsfaktor zur Verdünnung der Probe vom Stamm zum Well
( zB \(d=10\) bedeutet, dass die Probe 10 mal verdünnt wurde)
und dann diese zusätzlichen:
-
\( V = N \ v\): Gesamtes Partitionsvolumen, das in das Bohrloch injiziert wird
-
\( C_{0}\) : konzentration der Zielgene im Well (in Kopien/µL)
-
\( C = d \ C_{0}\) : Konzentration der Zielgene im Stamm (in Kopien/µL)
-
\(\ lambda = C_{0} \ v\) : durchschnittliche Anzahl der Zielgene pro Partition im Well
Die Verteilung der in den Partitionen des Bohrlochs eingekapselten Zielgene folgt einer Poisson-Verteilung des Parameters \(\lambda\) :
Proba (partition encapsulates \(\text{$k$}\) target genes ) \(= \dfrac{\lambda^k}{k!} e^{-\lambda}\)
Eine Partition wird gesagt:
-
“ Positive Partition“, wenn es mindestens 1 Zielgen eingekapselt hat (in diesem Fall werden wir eine fluoreszierende Partition am Endpunkt des Amplifikationsprozesses beobachten, so dass der größte Teil der Unsicherheit in dieser „mindestens einen“ Bedingung liegt)
-
“ Negative Partition“ if hat das Zielgen eingekapselt (in diesem Fall werden wir am Endpunkt des Amplifikationsprozesses eine nicht fluoreszierende Partition beobachten)
Die Verteilung der positiven Partitionen in der Vertiefung folgt einer Binomialverteilung der Wahrscheinlichkeit \(1 – e^ {-\lambda}\):
- Wahrscheinlichkeit (gut enthält \(\text{$p$}\) positive Partitionen \(= {\rm C}_{N}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- Wahrscheinlichkeit (Partition ist negativ) \( = e^{-\lambda} \)
- Wahrscheinlichkeit (Partition ist positiv) \( = 1 – e^{-\lambda} \)
Wenn \(N\) groß genug ist:
- Proba (Partition ist positiv) \(= \dfrac{p}{N} \)
Die Formel für die geschätzte Bestandskonzentration lautet also:
\( C = – \dfrac{d}{v} \ ln {\links(1 – \dfrac{p}{N} \rechts)} \)
Wenn Sie die geschätzten Konzentrationen von Zielgenen zusammen mit ihrem Konfidenzintervall und ihrer relativen Unsicherheit automatisch berechnen müssen, steht ein Online-Tool zur Verfügung: Poisson Law: Going Further. Probieren Sie es aus!
Weitere Informationen zu den Unsicherheitskurven sowie zu den Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen finden Sie unter dem Punkt: Dynamische Nachweisbereiche & Quantifizierung.