Die DNA-Gelelektrophorese ist eine Technik zur Trennung und Identifizierung von DNA-Fragmenten basierend auf der Größe.
DNA–Fragmente unterschiedlicher Größe werden in ein poröses Gel aus Agarose geladen – einem Kohlenhydrat, das in Rotalgen vorkommt.
Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wandern die Fragmente dank der negativ geladenen Phosphatgruppen in DNA-Nukleotiden durch das Gel.
Kleinere DNA-Stücke wandern leichter durch das Gel als größere Fragmente, die sich schwieriger durch die Gelmatrix bewegen können.
Wenn der Gel-Lauf abgeschlossen ist, kann die Position Ihrer DNA-Proben mit einer Reihe von Fragmenten oder Banden bekannter Größe verglichen werden, die als DNA-Leiter bezeichnet werden.
Das Vorhandensein Ihres Fragments von Interesse kann dann anhand seiner Größe bestätigt werden, die durch Vergleichen der relativen Position Ihrer Testprobe mit den Fragmenten der Leiter bestimmt wird.
Agarosegele werden unter Verwendung einer Gewichts- über Volumenprozentlösung hergestellt. 1 Gramm Agarose in 100 ml Puffer ergibt also ein 1% iges Gel. Gele mit niedrigerem Prozentanteil lösen größere Fragmente besser auf, und Gele mit höherem Prozentanteil erleichtern die Identifizierung kleinerer Fragmente. Um den Gelherstellungsvorgang zu starten, wiegen Sie die entsprechende Masse Agarose in einen Erlenmeyerkolben.
Laufpuffer in den Kolben geben, so dass das Puffervolumen nicht größer als 1/3 des Fassungsvermögens des Kolbens ist. Dann schwenken, um zu mischen.
Schmelzen Sie die Agarose / Puffer-Mischung durch Erhitzen in der Mikrowelle bei maximaler Leistung. Entfernen Sie alle dreißig Sekunden den Kolben und schwenken Sie den Inhalt, um ihn gut zu mischen. Wiederholen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat.
Als nächstes Ethidiumbromid zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml hinzufügen. Ethidiumbromid ist eine aromatische Verbindung, die zwischen einzelne Basenpaare von DNA passt, oder interkaliert, und bewirkt, dass DNA intensive orange Fluoreszenz unter UV-Licht emittiert. Es ist wichtig zu beachten, dass Ethidiumbromid ein Karzinogen ist, daher sollten beim Umgang mit Gelen, die diese Verbindung enthalten, immer Handschuhe getragen werden.
Um ein Verziehen der Gelschale zu verhindern, lassen Sie die Agarose abkühlen, indem Sie sie in ein 65ºC-Wasserbad stellen.
Während die Agarose abkühlt, bereiten Sie die Gelform vor, indem Sie die Gelschale in die Gießvorrichtung legen. Alternativ können Sie die offenen Kanten der Gelschale mit Klebeband abdichten, um die Form zu erstellen. Das Einsetzen eines Kamms in das Gel erzeugt die Vertiefungen, in denen DNA geladen wird. Stellen Sie sicher, dass der Kamm eine Vertiefung erzeugt, die die geeignete Größe für Ihre DNA-Probe hat.
Gießen Sie die geschmolzene Agarose in die Gelform und lassen Sie sie bei Raumtemperatur aushärten.
Nachdem die Agarose ausgehärtet ist, nehmen Sie den Kamm heraus. Wenn das Gel nicht sofort verwendet wird, wickeln Sie es in Plastikfolie ein und lagern Sie es bis zur Verwendung bei 4ºC.
Wenn das Gel sofort verwendet werden soll, legen Sie es in die Gelbox.
Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie den zu trennenden DNA-Proben einen gelladenden Farbstoff hinzu. Der Farbstoff wird typischerweise in einer 6-fachen Konzentration hergestellt. Loading Dye hilft bei der Visualisierung und dem Laden von Proben in die Bohrlöcher und hilft zu bestimmen, wie weit die Proben während des Laufs gewandert sind.
Stellen Sie die Stromversorgung auf die gewünschte Spannung ein.
Geben Sie nun genügend Laufpuffer in die Gelbox, um die Oberfläche des Gels zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass Sie denselben Laufpuffer verwenden, der zur Herstellung des Gels verwendet wird.
Schließen Sie die Kabel der Gelbox an die Stromversorgung an und schalten Sie sie ein. Denken Sie daran, dass DNA negativ geladen ist und sich in Richtung der Anode bewegt, die positiv und im Allgemeinen rot ist. Stellen Sie sicher, dass Sie das schwarze Kabel oder die Kathode nicht an den Boden der Gelbox anschließen. Sie vergessen also nicht, dass schwarze Katzen Pech haben oder negativ sind und die schwarze Katze daher negativ ist. Führen Sie Ihr Gel auf Rot oder die Anode. Um zu überprüfen, ob sowohl die Gelbox als auch die Stromversorgung funktionieren; Das Auftreten von Blasen an den Elektroden zeigt an, dass Strom durchläuft.
Entfernen Sie den Deckel der Gelbox. Laden Sie die DNA-Proben langsam und vorsichtig in das Gel. Auch hier ermöglicht der Ladefarbstoff in der Probe, dass die Probe in das Gel einsinkt, und hilft dabei, zu verfolgen, wie weit die Probe gereist ist. Ein DNA-Größenmarker oder Leiter sollte immer zusammen mit den experimentellen Proben geladen werden.
Setzen Sie den Deckel wieder auf. Überprüfen Sie, ob die Elektroden in die richtigen Steckplätze im Netzteil eingesteckt sind.
Schalten Sie das Gerät ein. Lassen Sie das Gel laufen, bis der Farbstoff in eine geeignete Entfernung gewandert ist.
Wenn der Elektrophoresevorgang abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und entfernen Sie den Deckel der Gelbox.
Entfernen Sie das Gel aus der Gelbox und lassen Sie überschüssigen Puffer auf der Geloberfläche ab. Legen Sie die Gelschale auf Papiertücher, um den verbleibenden Laufpuffer aufzunehmen.
Um die DNA-Fragmente sichtbar zu machen, entfernen Sie das Gel aus der Gelschale und setzen Sie das Gel ultraviolettem Licht aus.
DNA-Fragment sollte als orange fluoreszierende Banden erscheinen. Machen Sie ein Foto des Gels.
Am Ende des Experiments das Gel und den Puffer gemäß den Vorschriften der Institution ordnungsgemäß entsorgen. Denken Sie auch hier daran, das Gel und die laufenden Puffer immer mit Handschuhen zu handhaben, um eine Exposition mit Ethidiumbromid zu vermeiden.
Nun, da Sie gesehen haben, wie man DNA-Gelelektrophorese durchführt. Schauen wir uns einige nachgelagerte Anwendungen und Variationen dieser sehr nützlichen Methode an.
Hier sehen Sie ein Agarosegelelektrophoreseergebnis nach Trennung von PCR-Produkten. Die in das Gel geladenen DNA-Fragmente sind als klar definierte Banden sichtbar. Der DNA-Standard oder die Leiter sollte in einem Maße getrennt werden, das die nützliche Bestimmung der Größen von Probenbanden erlaubt. In diesem Beispiel werden DNA-Fragmente von 765 Basenpaaren, 880 Basenpaaren und 1022 Basenpaaren auf einem 1,5%igen Agarosegel mit einer 2-log DNA-Leiter getrennt.
Zusätzlich zur Bestätigung des Vorhandenseins eines DNA-Fragments von Interesse kann die DNA-Gelelektrophorese mit Gelreinigungsverfahren kombiniert werden. Typischerweise wird eine Rasierklinge verwendet, um das DNA-Fragment von Interesse auszuschneiden, so dass es gesammelt und die DNA-Probe darin wiederhergestellt werden kann.
Die Agarosegelelektrophese kann auch mit dem Transfer-Blotting kombiniert werden, bei dem DNA oder RNA auf eine Cellulosemembran übertragen werden können, wo radioaktive Sonden verwendet werden können, um spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen in Ihrer elektrophoretisch getrennten Probe zu identifizieren.
Die Standard-DNA-Gelelektrophorese ist nicht ideal für die Trennung von hochmolekularer DNA mit einer Größe von mehr als 15-20 kb, wie genomische DNA. Um große DNA-Proben zu trennen, wird eine Pulsfeldgelelektrophorese verwendet, bei der das Gel einem sich ändernden oder pulsierenden elektrischen Feld in verschiedene Richtungen ausgesetzt wird. Diese Technik beinhaltet eine spezielle Gel-Laufvorrichtung, die Elektrodenpaare aufweist, die in verschiedenen Ausrichtungen um das Gel angeordnet sind. Dies kann verwendet werden, um Unterschiede in der Genomgröße zwischen Populationen von Organismen zu erkennen, wie die gepoolten DNA-Proben aus verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften, Sie sehen hier, die aus verschiedenen Seeumgebungen entnommen werden.
Sie haben gerade eine Einführung in die DNA-Gelelektrophorese gesehen. Wir zeigten Ihnen das Konzept hinter der Methode, wie Sie das Agarosegel vorbereiten, wie Sie Ihre Proben laden, wie Sie das Gel ausführen und analysieren, sowie einige gängige Anwendungen der Agarosegelelektrophorese. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück beim Ausführen Ihres Gels.