Onkologieberichte

Einführung

Lungenkrebs ist ein bösartiger Tumor mit der höchsten Morbidität und Mortalität weltweit, und seine Inzidenz nimmt zu. Etwa 80% der Krankheit kann zugeschrieben werdennon-kleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC) (1). Aufgrund der Einschränkungen frühdiagnostischer Techniken und des Fehlens früher spezifischer klinischer Manifestationen werden 70-80% der Patienten in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert(2). Daher ist die Identifizierung einer sicheren und wirksamen medikamentösen Behandlung für NSCLC von entscheidender Bedeutung.

Jüngste Ergebnisse haben gezeigt, dass die Inzidenz, Entwicklung und Übertragung von NSCLC nicht nur durch genetische Faktoren beeinflusst werden, sondern dass auch epigenetische Veränderungen wichtig sind, einschließlich nicht-kodierender RNA (ncRNA) mit kleinen Molekülen (3). microRNA (miRNA), eine Klasse von endogenenkleine ncRNA mit einer Länge von ~ 21-25 Basen, die in Eukaryoten weit verbreitet ist, kann die mRNA eines spezifischen Zielgens identifizieren(4). Über 50% der miRNAs-Gene werden in NSCLC-bezogenen fragilen Stellen oder genomischen Regionen kartiert, was darauf hindeutet, dass die miRNA-Expression eng mit NSCLC assoziiert sein kann. Wie berichtet, die Expression einer großen Anzahl von miRNAs inNSCLC zeigen Störung und das Ungleichgewicht von miRNAs fördern theprogression von NSCLC Zellzyklus, anti-apoptotische Wirkung, enhancedcell Invasion und Metastasierung von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (5).

Der PI3K/Akt-Signalweg spielt eine wichtige Rolle beim Wachstumsfaktor-vermittelten Zellüberleben. Frühere Befunde haben gezeigt, dass die Störung des PI3K / Akt / mTOR-Signalwegs eine wichtige Rolle bei der Bildung von NSCLC spielen kann (6). Es wurde auch berichtet, dass das Zellproliferationssignal, das durch die Kombination einer Reihe von Transmembranrezeptoren und Liganden erzeugt wird, die Signaltransduktion von PI3K / Akt / mTOR aktivieren kann, die eng mit der NSCLC-Proliferation und dem Überlebensstatus verbunden ist (7). Zu diesen Rezeptoren gehören c-met, Epidermal Growth factor Receptor (EGFR), c-kit und Insulin-likegrowth Factor Receptor (IGF-IR).

Curcumin ist ein natürlicher Wirkstoff, der aus trockenem Rhizom der Kurkuma-Kurkuma-Gattung, Kurkuma und Kurkuma, mit umfangreichen pharmakologischen Wirkungen, geringer Toxizität und guter Verträglichkeit gewonnen wird und aufgrund seines wirtschaftlichen Wertes zu einem Hotspot für die Erforschung geworden ist (8). Ergebnisse von Studien, die sich auf Curcumin konzentrieren, haben eine breite Palette von pharmakologischen Aktivitäten wie entzündungshemmende, antioxidative, Lipid-, antivirale, antiinfektiöse, krebsbekämpfende, gerinnungshemmende, Leberfibrose und Atherosklerose, geringe Toxizität und wenige Nebenwirkungen identifiziert (9-13).Die Wirkung von Curcumin auf NSCLC und den zugrunde liegenden molekularen Mechanismus bleibt jedoch unklar. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die krebsbekämpfende Wirkung von Curcumin auf die Zellproliferation und Apoptose von humanem NSCLC und identifizierten eine mögliche Beziehung zwischen diesem Effekt und dem miRNA-192-5p-modulierten PI3K / Akt-Signalweg.

Materialien und Methoden

Chemikalien

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) und fetalcalf Serum (FBS) wurden von Gibco (Carlsbad, CA, USA) und (Südamerika) erworben. 3-(4,5-Dimethyl-thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wurde von Sangon Biotech (Shanghai, China) gekauft. Das Apoptose Detection Kit I wurde von gekauft BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Das Caspase-3-Aktivitäts-Assaykit wurde von Promega (Madison, WI, USA) bezogen.

Zellkultur

Menschliche normale NCL-H460- und BEAS-2E-Lungenepithelzellen und menschliche A549-Lungenkrebszellen wurden vom CellResource Center der Second Military Medical University erhalten. Diese Zellen wurden in DMEM, supplementiert mit 10% FBS (beide aus GIBCO), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37°C und einem Humidifid Inkubator mit 5% CO2 kultiviert. Die Konzentrationen (5,10,20 und 40 µM) und Zeiträume (12 und 24 h) von Curcumin gegen A549-Zellen wurden untersucht. Die chemische Struktur von Curcumin ist in Abb.1.

Analyse der Zelllebensfähigkeit

Die Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 103 / Well in 96-Well-Platten ausgesät. Kurz gesagt, Zellviabilitätwurde durch MTT-Assay (Sangon Biotech) gemessen. Zehn Mikroliter MTT (5 mg / l) wurden in jede Vertiefung gegeben und 4 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 inkubiert. Dimethylsulfoxid (150 µl; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) wurden zu jeder Vertiefung gegeben und 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Die Extinktion wurde bei 450 nM mit einem Amicroplate Reader gemessen.

Annexin V-FITC/Propidiumiodid (PI)Apoptose-Analyse

Zellen wurden mit einer Dichte von 1 ×106/ Well in 6-Well-Platten ausgesät. Kultivierte Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und dann mit Annexin V-FITC und PI mit dem Apoptose Detection Kit I gemäß den Anweisungen des Herstellers (BD Biosciences) gefärbt. Die Apoptose wurde mittels Flowzytometrie mit der Software CellQuest Pro (IVD) (beide von BDBiosciences) analysiert.

Caspase-3-Aktivierungsanalyse

Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 103 / Well in 96-Well-Platten ausgesät. Die Caspase-3-Aktivität wurde mit einem Caspase-3-Aktivitäts-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega) gemessen. Einhundert Mikroliterreaktionspuffer mit 10 µl Substrat Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroanilin (pNA) wurde in 10 µl Proteinzelllysat/Well gegeben und 6 h bei 37°C inkubiert. Die Caspase-3-Aktivität wurde bei einer Extinktion von 405 nm analysiert.

Zelltransfektion

Die MIR-192-5p, Anti-miR-192-5p und negative controlmimics (miR-NC) wurden alle von Sangon Biotech gekauft. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und vor der Transfektion auf 50-60% Konfluenz gezüchtet. Die Mimics wurden mit Lipofectamine2000 in Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen Life Technologies) transfiziert. Gen oder Protein wurde isoliert 24 Hafter-Transfektion und verwendet für reverse Transkription-Quantitativpolymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) oder Western-Blot-Analyse,beziehungsweise.

RT-qPCR

Zellen wurden mit einer Dichte von 5×103/well in 96-Well-Platten ausgesät. Gesamt-RNA wurde extrahiertaus den Zellen mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen Life Technologies).Die Konzentrations-RNA wurde mit einem NanoDrop®ND-1000 Spektralphotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc.,Wilmington, DE, USA). Die Quantifizierung der miRNAs erfolgte mit einem TaqMan miRNA Assay Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Die Gesamt-RNA wurde einer Erststrang-cDNA-Synthese unterzogen und unter Verwendung eines PrimeScript RT-Reagenzkits (beide von Takara, Shiga, Japan) untersucht. qPCR wurde mit SYBR-Green PCR Master Mix(Takara) auf dem ABI 7500HT System durchgeführt. Die dabei verwendeten Primer sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I Die in den Umsetzungen verwendeten PCR-Primer.

Western-Blot-Analyse

Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 103 / Well in 96-Well-Platten ausgesät. Kultivierte Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit eiskaltem Lysepuffer für 30 min auf Eis inkubiert. Zellflüssigkeit wurde gesammelt und bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert. Die lösliche Proteinkonzentration wurde mit einem BCA Protein Assay Kit (Sigma, St. Louis, MO, USA) bestimmt. Die Gesamtproteine (10 µg) wurden auf 12% Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgelen getestet und auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen transferiert. Die Membranen wurden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) blockiert, die 5% fettfreie Milch enthielt, um nicht-spezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Membranen wurden mit anti-PI3K (1:1500) und anti-Akt (1:1000) (beide von Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) und Anti-β-Actin (1:500; Sangon Biotech) über Nacht bei 4°C. Nach dem Waschen mit 1%Tween-20/PBS wurden die Membranen mit den Secondaryantikörpern (Tiangen, Beijing, China) für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.Der Nachweis der Proteine erfolgte mittels Enhanced Chemiluminescence (Vilber, Marne La Vallée, Frankreich).

Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit der Software SPSS 19.0 durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Ergebnisse wereanalyzed unter Verwendung des t-Tests des Studenten oder der Einweganalyse der Abweichung (ANOVA). P<0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Curcumin hemmt die Lebensfähigkeit von A549-Zellen

Die Konzentrationen (5, 10, 20 und 40 µM) und Zeiträume (12, 24 oder 36 h) von Curcumin gegen A549-Zellen wurden unter Verwendung des MTT-Assays bewertet. Abb.2 zeigt, dass die Behandlung von A549-Zellen für 12, 24 oder 48 h mit 10, 20 und 40 µM Curcumin die Zelllebensfähigkeit in einer dosis- und zeitabhängigen Weise inhibierte. Der MTT-Assay zeigte, dasscurcumin (20 und 40 µM) Behandlung für 24 oder 36 h führte zu einer unbedeutenden Zelllebensfähigkeit im Vergleich zur Kontrollgruppe(Abb. 2).

Curcumin induziert Apoptose von A549zellen

Vor der Behandlung wurde auch die apoptotische Rate von mit Curcumin behandelten (10, 20 oder 40 µM) A549zellen gemessen. Nach einer Behandlung mit 20 oder 40 µM Curcumin über 24 h stieg die apoptotische Rate dosisabhängig deutlich an, verglichen mit der Kontrollgruppe (Abb. 3).

Curcumin induziert die Caspase-3-Aktivität von A549-Zellen

Um festzustellen, ob Curcumin die Caspase-3-Aktivität von A549-Zellen induziert, wurde die Caspase-3-Aktivität unter Verwendung eines Acaspase-3-Aktivitäts-Assay-Kits gemessen. Die Caspase-3-Aktivität nahm auch dosisabhängig nach 24-stündiger Curcumin-Behandlung (20 oder 40 µm) signifikant zu, verglichen mit der Kontrollgruppe (Abb. 4). Diese Ergebnisse zeigten, dass Curcumin Apoptose in A549-Zellen induzierte.

miR-192-5p hemmt die Zelllebensfähigkeit und reduziert die Apoptose von A549-Zellen

Um die Expression und Bedeutung von MIR-192-5p in normalen menschlichen Lungenepithel- und Lungenkrebszellen zu untersuchen, wurde die relative Expression von miR-192-5p unter Verwendung von RT-qPCR nachgewiesen.Abb. 5A zeigt, dass die miR-192-5prälative Expression von NCL-H460-Zellen relativ niedriger war, die von a549-Zellen höher, wobei BEAS-2E-Zellen am stärksten exprimiert wurden.

Um zu analysieren, ob miR-192-5p die Zellviabilität und Apoptose von A549-Zellen beeinflusst, transfizierten wir miR-192-5pmimics in A549-Zellen. Die mit miR-192-5pmimics transfizierten Zellen zeigten nach 48 h Transfektion einen signifikanten, 120-fachen Anstieg der miR-192-5pexpression im Vergleich zur Kontroll- oder MIR-NC-Gruppe (Abb. 5B).Eine Überexpression von miR-192-5p verringerte die Lebensfähigkeit von A549-Zellen im Vergleich zur Kontroll- oder miR-NC-Gruppe (Abb. 5C). Die Überexpression von MS-192-5p induzierte jedoch die apoptotische Rate von A549-Zellen im Vergleich zur Kontroll- oder miR-NC-Gruppe (Abb.5D).

Hemmung von miR-192-5p unterdrückt cellviability und induziert apoptose von A549 zellen

Zu bestimmen, ob anti-miR-192-5p beeinflusst thecell lebensfähigkeit und apoptose von A549 zellen, wir transfectedanti-miR-192-5p imitiert in A549 zellen. Der Expressionsgrad von r-192-5p wurde mittels RT-qPCR nach 48 h Transfektion nachgewiesen.Anti-miR-192-5p-Mimics unterdrückten effektiv die miR-192-5prelative Expression von A549-Zellen (Abb.6A). Die Herunterregulierung von miR-192-5p förderte die Zelllebensfähigkeit und hemmte die apoptotische Rate von A549-Zellen im Vergleich zur Kontroll- oder miR-NC-Gruppe (Abb.6B und C).

Curcumin hemmt die miR-192-5p-Genexpression von A549-Zellen

Um festzustellen, ob Curcumin die miR-192-5pgen-Expression von A549-Zellen beeinflusst, wurde das Expressionsniveau von miR-192-5p unter Verwendung von RT-qPCR nach 24-stündiger Behandlung mit Curcumin nachgewiesen. 7 zeigt, dass der Expressionlevel von miR-192-5p durch Curcumin deutlich erhöht wurde (20 oder 40µM).

miR-192-5p hemmt die Wirkung von Curcumin auf die Zelllebensfähigkeit und induziert die Apoptose von A549-Zellen

Um zu untersuchen, wie die Überexpression von miR-192-5p die Wirkung von Curcumin auf die Zelllebensfähigkeit und die apoptotische Rate von A549-Zellen beeinflusst, transfizierten wir miR-192-5p-Mimik in A549-Zellen. Abb. 8 zeigt, Dasscurcumin die Zelllebensfähigkeit unterdrückte und die apoptotische Rate von A549-Zellen nach einer Behandlung mit Curcumin (20 µM) für 24 h im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte. Die Wirkung von Curcumin (20 µM) auf die Zelllebensfähigkeit und die apoptotische Rate von a549-Zellen wurden durch miR-192-5pmimics im Vergleich zur mit Curcumin behandelten Gruppe (Abb. 8A).

Die Hemmung von miR-192-5p unterdrückt die Wirkung von Curcumin auf die Zelllebensfähigkeit und induziert die Apoptose von A549zellen

Um zu untersuchen, wie die Herunterregulierung von miR-192-5p die Wirkung von Curcumin auf die Zelllebensfähigkeit und die apoptotische Rate von A549-Zellen beeinflusste, transfizierten wir Anti-miR-192-5p-Mimiksinto A549 zellen. Abb. 9 zeigt, dasscurcumin die Zelllebensfähigkeit unterdrückte und die apoptotische Rate von A549-Zellen nach einer Behandlung mit Curcumin (20 µM) für 24 h im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte. Die Wirkung von Curcumin (20 µM) auf die Zelllebensfähigkeit und die apoptotische Rate von A549-Zellen wurden jedoch durch Anti-miR-192-5p-Nachahmer im Vergleich zur mit Curcumin behandelten Gruppe deutlich erhöht bzw. verringert (Abb.9A).

Curcumin hemmt die PI3K/Akt-Proteinexpression von A549-Zellen

Um festzustellen, ob Curcumin die PI3K/Akt-Proteinexpression von A549-Zellen beeinflusst, wurde die PI3K/Akt-Proteinexpression nach 24-stündiger Behandlung mit Curcumin mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen. 10 zeigt, dass die PI3K/Akt-Proteinexpression durch Curcumin (20 oder 40 µM) deutlich verstärkt wurde.

miR-192-5p zielt direkt auf PI3K / Akt von A549-Zellen ab

Um zu untersuchen, wie die Überexpression von miR-192-5p die PI3K / Akt-Proteinexpression von A549-Zellen beeinflusst, haben wir miR-192-5p in A549-Zellen imitiert. Abb. 11A und B zeigt, dass Curcumin die PI3K/ Akt-Proteinexpression von A549-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit Curcumin (20 µM) im Vergleich zur Kontrollgruppe unterdrückte. Die Wirkung von Curcumin (20 µM) auf die P3K / Akt-Proteinexpression von A549-Zellen wurde durch MIR-192-5p-Mimiks im Vergleich zur mit Curcumin behandelten Gruppe (Abb. 11C und D).

Die Hemmung von miR-192-5p erhöht die PI3K / Akt-Expression von A549-Zellen

Um festzustellen, ob Anti-miR-192-5p die Wirkung von Curcumin auf die PI3K / Akt-Proteinexpression von A549-Zellen beeinflusst hat, haben wir Anti-miR-192-5p in A549-Zellen imitiert. Abb. 12A und B zeigen, dass Curcumin die PI3K/Akt-Proteinexpression von A549-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit Curcumin (20 µM) im Vergleich zur Kontrollgruppe unterdrückte. Die Wirkung von Curcumin (20 µM) auf die PI3K / Akt-Proteinexpression von A549-Zellen wurde jedoch durch Anti-miR-192-5p-Mimika im Vergleich zu der mit Curcumin behandelten Gruppe (Abb.12C und D).

Weltweit erliegen jährlich eine Million Patienten NSCLC, und die Inzidenz von NSCLC nimmt allmählich zu.Obwohl sich in den letzten Jahren eine Reihe von Studien auf NSCLC konzentriert haben,wurden hinsichtlich der Behandlung keine großen Fortschritte erzielt. Chirurgie bleibt die effektivste Behandlungsmethode, aber in Bezug aufPrävention sowie für die Pathogenese von NSCLC müssen weitere Studien durchgeführt werden (14,15). Kürzlich identifizierten Liu et al., dass Curcumin die Proliferation hemmt und die zellapoptotische Rate von Magenkrebszellen signifikant induziert (16). Zeigten, dass Curcumin das Zellwachstum und die Invasion von Pankreaskrebszellen hemmt (17). Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse, dass Curcumin die Zelllebensfähigkeit unterdrückte, die Zellapoptose induzierte und die Caspase-3-Aktivität von A549-Zellen erhöhte.Daher ist Curcumin ein potenzielles Medikament für die Onkotherapie.

miRNA ist eine Klasse von niedermolekularer RNA, die eine sehr wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression spielt, wie kürzlich identifiziert wurde (18). miRNA-Gene befinden sich normalerweise in Intronsegmenten des Gens. miRNAs sind jedoch auch außerhalb nicht kodierender Exons des Gens und der intergenen Region verteilt, die an einer Vielzahl bekannter onkogener Signalwege wie p53, Bcl-2 und K-Ras beteiligt sind (19). Es wurde gezeigt, dass > 50% der definierten humanen miRNAs in den fragilen Stellen des Genoms lokalisiert sind und diese fragilen Stellen häufig mit dem Auftreten von NSCLC assoziiert sind (20). Die Expressionsprofile von miRNAs sind mit der Entwicklung von NSCLC assoziiert. miR-34c, miR-145 und miR-142 können NSCLC hemmen (5). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie deuten darauf hin, dass die relative Expression von miR-192-5p von NCL-H460-Zellen relativ niedrig war, die von A549-Zellen höher, wobei BEAS-2E-Zellen am stärksten exprimiert wurden. Die Überexpression von miR-192-5p verringerte die Zelllebensfähigkeit und erhöhte die apoptotische Rate von A549-Zellen. Downregulation von miR-192-5p erhöhte die cellviability und verringerte die apoptotic Rate von Zellen A549.Zusätzlich hemmte Curcumin die miR-192-5p-Genexpression von A549cells. Die Hochregulierung der miR-192-5p-Expression verstärkte jedoch die Wirkung von Curcumin auf die Zelllebensfähigkeit und die apoptotische Rate von A549-Zellen, während die Herunterregulierung der miR-192-5p-Expression die Wirkung von Curcumin auf A549-Zellen umkehrte. Unsere Ergebnisse stimmten mit denen anderer Studien überein. Zum Beispiel berichteten Ye et al, dass Curcumin die Zellapoptose fördert, indem es CAS-192-5p aktiviert (21). Die wahrscheinlichen Mechanismen, wie Curcumin die miR-192-5p-Expression beeinflusst, sind jedoch unklar, und zukünftige Studien zur Bestimmung dieses Effekts sollten durchgeführt werden.

In den letzten Jahren hat die Wirkung des PI3K/ Akt-Signalwegs auf das humane NSCLC viel Aufmerksamkeit erhalten(22). Die Aktivierung des PI3K / Akt-Signalwegs ist bei humanem NSCLC sehr häufig, was das Auftreten von Krebs durch eine Vielzahl von Mechanismen fördern kann, einschließlich Genmutationen, Verringerung der PTENexpression des Krebssuppressorgens, PI3K-Mutation oder -amplifikation, Akt-Mutation oder -amplifikation und Onkogenrezeptoraktivierung (7). Die Aktivierung jeder Komponente dieses Pfades ist der Hauptgrund für die ungünstige Prognose von NSCLC, die zu einer Arzneimittelresistenz der Behandlung führen kann, so dass die Hemmung dieses Pfades die Arzneimittelresistenz umkehren und die Chemotherapie- und Strahleneffekte in vivo verbessern kann (23). Die in der vorliegenden Studie erhaltenen Daten zeigten, dass Curcumin die PI3K / Akt-Proteinexpression von A549-Zellen unterdrückte. Die Hochregulierung der miR-192-5p-Expression reduzierte die PI3K / Akt-Proteinexpression von A549-Zellen.Eine Herunterregulierung der miR-192-5p-Expression kann die PI3K / Aktprotein-Expression von A549-Zellen erhöhen. Haben gezeigt, dass Curcumin die Invasion und Migration von FTC133-Zellen durch Herunterregulierung des PI3K / Akt-Signalwegs in Thyreoidkrebszellen hemmt (24). Xu et alschlug vor, dass Curcumin die Tumorproliferation von Lungenkrebs durch den PI3K / Akt-Weg hemmt (25).Offenbarten, dass miR-22-3p, miR-143-3p und MIR-192-5p reguliert und an APC, TGFß und PI3Kpathway in Darmkrebszellen beteiligt waren (26).

Abschließend konzentrierte sich diese Studie auf die Wirkung von Curcumin gegen A549-Zellen, hemmte die Zellproliferation und induzierte die Apoptose des menschlichen NSCLC durch die Hochregulierung von PD-192-5p und die Unterdrückung des PI3K / Akt-Signalwegs. Die Schlussfolgerungen der vorliegenden Studie zeigen, dass Curcumin ein potenzielles Ziel bei der Behandlung von NSCLC ist. Die vorliegende Studie ergab jedoch einige Einschränkungen, da wir die detaillierte Beziehung zwischen miR-192-5p und dem PI3K / Akt-Signalweg in Lungenkrebszellen nicht untersuchten. Zusätzliche Studien in vivo, klinische und umfassendere statistische Analysen der vorliegenden Studie sollen durchgeführt werden, um die Ergebnisse zu verifizieren.