Descripción conceptual y práctica de la tecnología de microarray de ADNc: implicaciones para las ciencias básicas y clínicas

Braz J Med Biol Res, octubre de 2005, Volumen 38(10) 1543-1552 (Revisión)

Descripción conceptual y práctica de la tecnología de microarray de ADNc: implicaciones para las ciencias básicas y clínicas

V. de Mello-Coelho y K. L. Hess

Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

Resumen
Texto

Correspondencia y notas de pie de página

Resumen

El microarray de ADNc es una tecnología innovadora que facilita el análisis de la expresión de miles de genes simultáneamente. La utilización de esta metodología, que evoluciona rápidamente, requiere una combinación de conocimientos especializados de las ciencias biológicas, matemáticas y estadísticas. En esta revisión, intentamos proporcionar una visión general de los principios de la tecnología de microarreglos de ADNc, las preocupaciones prácticas del procesamiento analítico de los datos obtenidos, la correlación de esta metodología con otros métodos de análisis de datos, como la inmunohistoquímica en microarreglos de tejidos y la aplicación de microarreglos de ADNc en distintas áreas de las ciencias básicas y clínicas.

palabras Clave: Biotecnología, microarray de ADNc, Expresión génica, Genómica

Introducción

Los genes son unidades hereditarias formadas por secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) organizadas en cromosomas en el núcleo celular. El intrincado proceso de transcripción de estas secuencias da como resultado la generación de ácidos ribonucleicos mensajeros (ARNm). Estos ARNm codifican para proteínas, que están compuestas de aminoácidos, y llevan a cabo la función designada del gen (1). Por lo tanto, las características estructurales y funcionales de las células y los tejidos están determinadas por la expresión simultánea, selectiva y diferencial de miles de genes.

Desde la última década, los estudios relacionados con el mapeo de genes, la clonación y la secuenciación han proporcionado información significativa para el análisis estructural de genomas distintos (2,3). La cantidad de información obtenida de estas investigaciones requiere la organización de los datos adquiridos. Para satisfacer esta necesidad, se han creado bases de datos públicas para almacenar millones de secuencias de genes y etiquetas de secuencias expresadas (EST), lo que permite acceder a secuencias de genes para analizar las similitudes y las diferencias entre genomas de distintas especies (4).

Los estudios estructurales de genomas han planteado numerosas cuestiones relacionadas con la comprensión funcional y reguladora de los perfiles de expresión génica en distintos tipos de células y tejidos de diversos organismos (3,5,6). La tecnología de microarrays de ADN se desarrolló para estudiar el complejo procesamiento biológico que involucra a varios miles de genes (7,8). Una de estas tecnologías de microarrays utiliza hilos o sondas de ADN individuales (oligómeros) que se imprimen en una superficie de vidrio mediante fotolitografía (9). Otra metodología de microarrays de ADN, en la que se centra la presente revisión, es la tecnología de microarrays de ADN complementario (ADNc) (10). Con estas metodologías es posible 1) comparar simultáneamente el patrón de expresión dinámica de miles de genes en células o tejidos, 2) detectar diferencias moleculares durante distintas etapas de los procesos celulares, por ejemplo, diferenciación, proliferación e inducción de apoptosis, 3) identificar diferencias transcripcionales entre condiciones no enfermas y patológicas, 4) identificar cambios en las células debido a una respuesta a un fármaco, y 5) identificar biomarcadores nuevos para su uso potencial en el diagnóstico, pronóstico y terapia clínica de enfermedades.

Los principios de la tecnología de microarreglos de ADNc

Una metodología clásica utilizada para la detección y cuantificación de ARNm en una célula dada se llama análisis de blot del Norte (11). El principio principal del análisis de Northern blot es la hibridación de una sonda específica de un gen radiomarcado a un ARNm unido a un filtro, con el fin de determinar si ese gen está presente. Otro método utilizado para detectar la expresión de un gen específico es la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). La RT-PCR implica el uso de cebadores específicos de genes y transcriptasa inversa para sintetizar una secuencia de ADNc en el ARNm. El ADNc es amplificado por múltiples rondas de transcripción mediada por polimerasa de este ADNc plantilla (12). Existen varios tipos de RT-PCR y el más preciso en términos de cuantificación es el método RT-PCR en tiempo real, que requiere un sistema automatizado capaz de detectar la fluorescencia inducida durante la reacción RT-PCR (12). Durante la RT-PCR, la expresión de un determinado gen se puede deducir comparándolo con genes constitutivamente expresados, también conocidos como genes de «limpieza».

La tecnología de microarreglos de ADNc, que analiza los niveles de expresión génica de miles de genes simultáneamente, se basa en los mismos principios que los de los análisis de blot Septentrional y RT-PCR (7,8). Esencialmente, el microarray de ADNc es la hibridación de miles de genes de ADNc a sus objetivos correspondientes en un chip o filtro. Sin embargo, el desafío actual de esta tecnología es analizar las cantidades sustanciales de datos numéricos brutos obtenidos a través de la adquisición de señales de hibridación (13). Los análisis computacionales y bioestadísticos son necesarios para procesar con precisión datos significativos para los objetivos específicos de la investigación (Figura 1).

Producción de una matriz de microarreglos de ADNc

Recientemente, varias empresas han diseñado microarreglos de ADNc centrados en sistemas específicos de perfil de expresión génica. Estas matrices están disponibles comercialmente en empresas de biotecnología, incluidas SuperArray Bioscience Corporation y Affymetrix, para su uso a precios asequibles. En esta sección, tratamos de describir los pasos básicos en la producción de una matriz de microarray de ADNc.

El primer paso para producir una matriz de microarray de ADNc es la selección y amplificación de fragmentos totales o parciales de secuencias de ADNc que se imprimirán en sustratos, que posteriormente se hibridarán con secuencias de ADNc objetivo (14,15). Los métodos más comunes para seleccionar secuencias se basan en los siguientes recursos: 1) bancos de datos genéticos como Unigene, dbEST y GenBank, que proporcionan información sobre la función del gen específico y la localización cromosómica; 2) colecciones de clones o secuencias de ADNc disponibles en páginas web de empresas comerciales; 3) construcciones personalizadas de bibliotecas de ADNc a partir de material de células diana o tejidos clonados previamente y secuenciados para la identificación de EST. Una vez seleccionados, los fragmentos de ADNc se amplifican mediante PCR en microplacas de múltiples pocillos, se purifican mediante precipitación química y luego se examinan su calidad y cantidad mediante electroforesis en gel. Los productos de PCR se imprimen en un portaobjetos o membrana utilizando una máquina robótica, el microarrayer. Durante la impresión robótica, o deposición, del ADN, los tubos capilares reciben una presión constante y depositan en serie el ADN en el portaobjetos o membrana, creando así un diseño de «microarray» (16). Varios tipos de sustratos, incluidos portaobjetos de vidrio y membranas de nailon, son pretratados para aumentar sus cargas hidrofóbicas, lo que resulta en un aumento de la adherencia total de las secuencias de ADN a los sustratos (13). Lo más importante es que la indexación de datos que contiene la ubicación de miles de clones de ADNc impresos en los sustratos se realiza mediante un etiquetado cauteloso de cada microplaca utilizando un software diseñado para el análisis de bases de datos. Esta base de datos también incluye la identidad del clon (ID de clon), el nombre del gen, la ubicación del cromosoma y la(s) función (es) del gen.

Hibridación de la sonda de ADNc con la matriz de microarrays de ADN diana

Un factor crucial para la hibridación exitosa de la sonda de ADNc con la matriz de microarrays de ADN diana depende de la calidad del ARNm de células o tejidos. Los contaminantes del ARN de la sonda con ADN genómico, proteínas o residuos de detergente pueden dar lugar a datos falsos positivos/falsos negativos.

El etiquetado de la sonda durante la síntesis de ADNc por transcripción inversa de secuencias de ARN depende del tipo de microarray de ADNc que se utilice (16). En general, cuando el análisis de microarreglos de ADNc se realiza utilizando membranas de nylon como sustrato, el ARN de la sonda se etiqueta radioactivamente mediante la incorporación de nucleótidos dCTP-P33 durante el proceso de transcripción inversa (7). En el caso de un microarray de ADNc impreso en portaobjetos de vidrio, se utilizan nucleótidos radiactivos (17) y tintes fluorescentes con altas tasas de incorporación de eficiencia, como las cianinas Cy-3 dUTP y Cy-5 dUTP (8). Para obtener más información sobre los tipos de microarrays de ADNc y el proceso de hibridación (7,8,17-20), consulte la Tabla 1.

Todavía se están desarrollando herramientas de análisis para la identificación de patrones de expresión génica utilizando tecnología de microarreglos de ADNc

Herramientas para el análisis de cantidades masivas de datos generados a partir de microarreglos de ADNc. Actualmente, los investigadores analizan los datos de microarreglos de ADNc utilizando diversos programas de software (21-24). Esto significa que no hay un método único para analizar la cantidad masiva de datos obtenidos utilizando esta tecnología. El uso de herramientas bioestadísticas se ha vuelto cada vez más importante en el análisis de la importancia de los perfiles de expresión génica.

Para proporcionar una idea general sobre algunos de los tipos de métodos utilizados para analizar los datos de microarreglos de ADNc, describiremos y discutiremos los pasos que podrían dificultar el proceso de análisis. De suma importancia es la validación de los resultados completando múltiples experimentos replicados. Después de la adquisición de las señales de hibridación, los sustratos se examinan visualmente utilizando programas computacionales. En este caso, se considera la calidad de los sustratos. Por ejemplo, las imágenes de manchas borrosas, los precipitados de tinte o las muestras con señales de fondo fuertes generalmente se descartan. Este análisis es importante para eliminar artefactos, que pueden resultar en la detección de señales falsas positivas (16). Varios investigadores aplican el método de sustracción de fondo de las señales de hibridación a las señales inespecíficas en el fondo. En este paso, dependiendo del software utilizado, es posible restar señales de fondo de las dos maneras siguientes: 1) por la media aritmética o mediana resultante de la intensidad de la señal entre las señales positivas de puntos en el sustrato, o 2) por la media aritmética o mediana de la señal inespecífica, como la intensidad de la señal resultante del área inmediata alrededor de cada punto correspondiente a una señal génica específica. Mediante estos dos métodos, los valores de media o mediana aritmética se restan de la señal positiva que representa un gen expresado diferencialmente (16). La adquisición de intensidad de señal positiva en cuadrículas de localización creadas utilizando software específico se completa en valores arbitrarios conocidos como algoritmos. Estos valores se pueden acceder directamente en el software de la base de datos, que contiene información previamente catalogada de cada gen impreso en el sustrato.

Debido a la enorme cantidad de genes analizados simultáneamente y la variabilidad en todos los pasos técnicos de la técnica de microarray de ADNc, es importante crear un factor de ajuste o compensación, que se realiza a través de un proceso de normalización de datos. La existencia de señales inespecíficas en los sustratos, los problemas relacionados con la cantidad o la calidad del ARN antes de la hibridación, o la variabilidad en la incorporación del ARN en la sonda pueden resultar en un deterioro de la normalización de la muestra (14,16). Para una interpretación más significativa de los datos, el proceso de normalización realiza un análisis comparativo de la media aritmética de los algoritmos de un grupo individual con otro, frecuentemente elegido como control (24,25). Hay varios tipos de métodos de normalización y seleccionar el método más apropiado puede ser un desafío. La razón de esto es que múltiples variables experimentales a menudo impiden la identificación precisa de genes expresados diferencialmente sin resultados falsos positivos/falsos negativos que contaminen la evaluación de los datos. El soporte matemático, estadístico y bioinformático es crítico en esta etapa de la tecnología de microarreglos de ADNc.

los métodos de normalización incluyen: 1) la relación logarítmica de los niveles de expresión medidos entre distintos grupos en función de la media, mediana, diferencias medianas o varianza obtenidas de todas las señales positivas ubicadas en los sustratos; 2) análisis de regresión, que se evalúa a través del coeficiente de correlación o distancia euclidiana, y se basa en la distribución representada por los algoritmos correspondientes a las intensidades de señal en las distintas muestras del mismo grupo, y 3) pruebas estadísticas como la prueba t o el análisis asociativo, que consideran comparaciones múltiples emparejadas basadas en el umbral significativo de P < 0.05 y la corrección de significancia del umbral de la prueba t, respectivamente (25,26). Además, el método de normalización de regresión lineal ponderada localmente (lowess), utilizado con frecuencia para matrices fluorescentes, explica las variaciones decrecientes de las señales de hibridación de intensidad y la ubicación espacial del ADNc manchado en el portaobjetos (27).

Después de la normalización, el método más simple para identificar diferencias entre patrones de expresión génica es usar la diferencia de proporción entre una muestra y su control apropiado. En este caso, se establece un límite arbitrario y a partir de este valor es posible seleccionar los genes expresados diferencialmente utilizando software de base de datos. Por ejemplo, es posible establecer un umbral de 2 veces para identificar genes con cambios significativos en el nivel de expresión. Durante este proceso, los genes dentro de este rango se seleccionarán y organizarán en tablas ubicadas en la base de datos. Los genes que cumplen los criterios de selección se pueden visualizar a partir de bases de datos utilizando un software que muestra mapas autoorganizados (28,29). Además, estos cambios en los perfiles de expresión génica entre distintos grupos se pueden visualizar en dendrogramas basados en análisis de agrupamiento jerárquico (25,29,30). En este caso, los genes que están regulados hacia abajo generalmente se muestran en verde y los genes regulados hacia arriba generalmente se muestran en rojo. A medida que la diferencia de regulación génica es más intensa, también lo es su color respectivo. Los programas de software para analizar los datos de los microarreglos de ADNc están disponibles a través de Internet.

Es importante tener en cuenta que el análisis de los perfiles de expresión génica adquiridos por la tecnología de microarreglos de ADNc implica que miles de genes se analizan simultáneamente. Antes de realizar estudios fisiológicos de genes seleccionados, los resultados de los microarreglos de ADNc deben confirmarse a nivel de ARN mediante análisis de frotis septentrional o RT-PCR en tiempo real (14). Esto elimina la posibilidad de resultados de microarreglos de ADNc falsos positivos debido a la hibridación cruzada entre genes dentro de la misma familia de genes. También se recomienda una confirmación adicional a nivel de proteínas, por ejemplo, mediante análisis de Western blot, citometría de flujo o inmunohistoquímica. En este contexto, actualmente es posible evaluar genes a nivel de proteínas utilizando ensayos de microarray tisular (31-33). El ensayo de microarray tisular es un método que permite la evaluación de hasta mil tejidos a la vez utilizando un marcador específico. Básicamente, pequeñas biopsias de núcleo de 1 mm o menos se aíslan de bloques de tejido incrustados en parafina individuales con un dispositivo metálico especial o una aguja, y se colocan en otro bloque de parafina de manera ordenada. Las ventajas de esta técnica son: 1) la economía y preservación de las muestras de tejido originales obtenidas para la biopsia para construir el conjunto; 2) para evitar problemas técnicos, ya que el conjunto está construido en un único portaobjetos de vidrio, facilitando así los procesos técnicos de lavado y tinción, y 3) la velocidad para realizar análisis in situ simultáneamente en varias muestras de tejido a la vez. Clínicamente, es una técnica poderosa para usar conjuntamente con el análisis de microarreglos de ADNc para identificar nuevos biomarcadores para su uso potencial como herramientas diagnósticas, pronósticas y terapéuticas contra condiciones patológicas (31,32).

Tecnología de microarray de cDNA: aplicaciones y perspectivas

En términos de aplicación, la tecnología de microarreglos de ADNc conduce a la identificación de genes específicos y permite a los investigadores comparar los perfiles de expresión génica en condiciones normales versus patológicas en varios organismos. En la ciencia básica, el microarray de ADNc se ha utilizado para identificar el papel de varios genes involucrados en procesos celulares, como la diferenciación celular, a través de la comparación de patrones de expresión génica entre cultivos celulares normales y transfectados, por ejemplo (34). Muchos grupos de investigación han utilizado la tecnología de microarray de ADNc para estudiar distintos tipos de cáncer, así como la patogénesis de enfermedades infecciosas (35-40). En este caso, la identificación de genes nuevos o cambios en los patrones de expresión génica en los tejidos de un estado no enfermo a otro enfermo ha contribuido a comprender mejor los mecanismos moleculares que regulan la aparición y el progreso de las enfermedades. Además, el microarray de ADNc se ha considerado una metodología muy interesante en la industria farmacéutica. En este contexto, el análisis del perfil de expresión génica en gran escala de células sometidas a distintas pruebas farmacológicas podría ser relevante para clasificar agentes potenciales para uso terapéutico (41). En la Tabla 2 se describen varios ejemplos de la aplicación de la metodología de microarray de ADNc en ciencias básicas y clínicas (34-48).

El análisis de microarreglos de ADNc es una metodología costosa, pero la abundancia de resultados generados a partir de esta tecnología es una recompensa incuestionable. Una vez que se organiza una unidad central de investigación para el desarrollo de esta metodología, varios investigadores pueden disfrutar de la ventaja de utilizar sustratos de microarray de ADNc impresos previamente para investigar genes expresados diferencialmente en áreas biológicas y clínicas. Para la organización de unidades de microarreglos de ADNc, se debe considerar la interacción multidisciplinaria entre los ámbitos matemático y biológico. En la Figura 2 se muestra un modelo esquemático hipotético simple que demuestra la infraestructura de una unidad de microarray de ADNc.

Finalmente, se han creado bancos centralizados que contienen datos de perfiles de expresión génica analizados por tecnología de microarreglos de ADNc y están disponibles para su inspección a través de Internet (49,50). De esta manera, diferentes grupos de todo el mundo podrán comparar los datos de perfiles genéticos seleccionados con otros depositados en bancos de datos moleculares, como Gene Expression Omnibus o Array Express, diseñados por el Instituto Europeo de Bioinformática (51).

Un problema que ha restringido una interacción beneficiosa entre varios grupos de investigación que utilizan la tecnología de microarreglos de ADNc es la falta de estándares para presentar e intercambiar resultados. Para compensar esta situación, se creó la Información Mínima para la Anotación de un Experimento de Microarrays (MIAME) (52). La Micro-array Gene Expression Data Society (MGED) ha propuesto directrices para la estandarización de los experimentos con microarray de ADNc. MIAME se compone básicamente de seis secciones: 1) diseño experimental; 2) diseño de matrices; 3) muestras utilizadas, preparaciones de extractos e hibridación; 4) procedimientos y parámetros de hibridación; 5) imágenes, cuantificación y medición de parámetros, y 6) tipos, valores y especificaciones para controles de normalización. MIAME se ha convertido en un requisito para publicar los resultados de los microarray de ADNc en muchas revistas científicas. Además, distintos grupos, incluidos MGED, Rosetta, Agilent y Affymetrix, han trabajado juntos utilizando bioinformática para diseñar la expresión génica de microarray (MAGE), que es una plataforma de estructura flexible común que permite la comunicación entre diferentes grupos de investigación que utilizan la tecnología de microarray de ADNc. MAGE se compone de lo siguiente: 1) MAGE – ON (modelo de objetos), un modelo de datos centrado que utiliza un lenguaje de modelado unificado e implementa los requisitos de MIAME; 2) MAGE-ML (lenguaje de marcado), que documenta la traducción de MAGE-OM a un formato de datos basado en XML, y 3) MAGE-SLK, un software de libre acceso que define la interfaz de los programadores de aplicaciones a MAGE-OM, permitiendo así la exportación de datos a MAGE-ML y, posteriormente, el almacenamiento de datos en una base de datos relacional (53).

Recientemente, la nanotecnología se ha implementado ampliamente en diversos ámbitos, como aplicaciones industriales, farmacéuticas y gubernamentales, para mejorar los avances científicos modernos. Debido a las características físicas y químicas únicas de las nanopartículas, estos materiales tienen la capacidad de mejorar los dispositivos sensoriales, los aditivos de propulsión, las técnicas de remodelación de tejidos y los mecanismos de orientación de medicamentos. Además, se ha utilizado la nanotecnología para mejorar la capacidad de los microarreglos (54) y para ayudar en el desarrollo de nanorreglos de proteínas (55). En el entorno de laboratorio, los científicos están comenzando a investigar el impacto potencial positivo/negativo que las nanopartículas tienen en la inducción/inhibición de genes dentro de las células mediante la técnica de microarrays (56). Por último, la combinación de la nanotecnología con la tecnología de microarrays incluso ha avanzado el conocimiento actual de los genes regulados diferencialmente durante los procesos de la enfermedad (57,58).

En conjunto, estas herramientas pueden contribuir a la comprensión de nuevas funciones génicas en diversos genomas y de cómo se correlacionan con la patogénesis de enfermedades en humanos. El desarrollo y la aplicación de la tecnología de microarreglos de ADNc han traído mucho progreso al descubrimiento de medicamentos, diagnósticos de investigación y terapia génica potencial destinada al tratamiento de diversas enfermedades. Esta tecnología fundamental ayuda a los investigadores a comprender los mecanismos moleculares involucrados en múltiples y diversos procesos biológicos.

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