materiaalit ja menetelmät
Duplex-DNA: n valmistelu. 30-bp duplex-DNA-molekyylien valmistamiseksi hybridisoitiin kaksi oligonukleotidia, joilla oli seuraava sekvenssi ja muunnokset (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotidi 5′-GGGTATGGAGATTAGC-3′ merkittiin Cy5: llä sen 5′ – päässä ja Cy3: lla sen 3 ’ – päässä. Komplementtioligonukleotidi merkittiin biotiinilla molemmissa päissä.
proteiinin ilmentyminen ja puhdistus. PCR poisti keltaisen fluoresoivan proteiinin (YFP) geenin p2bac/pFastBac-YFP-M5-CaM plasmidista (lahja H. Lee Sweeneyltä Pennsylvanian yliopistosta Philadelphiasta). Tuloksena saatu p2bac / pFastBac-M5-CaM plasmidi koodaa kanamyosiini V: tä, joka typistetään Glu-1099: ssä. Leusiini vetoketju seurasi native coiled kela varmistaa dimerisaatio. Puhdistuksen helpottamiseksi myosiini V-proteiini merkittiin N-terminaalisesti LIPPULAPULLA (DYKDDDK). Kaksi rekombinanttibakulovirusta syntyi proteiinien ilmentymistä varten Sf9-soluissa. Yksi koodasi typistetyn myosiini V: n ja Drosophila melanogaster kalmoduliinin, joka on johdettu p2bac/pFastBac-M5-CaM-plasmidista. Toinen virus koodasi ihmisen välttämättömän valon ketjun, joka oli johdettu p2bac/pFastBac-ELC-plasmidista. Molempia viruksia käytettiin Sf9-solujen samanaikaiseen infektioon. Proteiini ilmaistiin ja puhdistettiin Sweeneyn et al. (20).
Kalmoduliinin Merkintä ja vaihto. Kalmoduliini ilmaistiin ja merkittiin sy3: lla tai sy5: llä seuraavasti: merisiilin kalmoduliin lisättiin yksi kysteiini mutaation Q143C avulla. Tämä kalmoduliini ilmaistiin Escherichia coli ja puhdistettu kuvatulla tavalla ref. 21. Kalmoduliini merkittiin joko sy3-maleimidin tai sy5-maleimidin (Amersham Biosciences) kantaliuoksilla (DMSO: ssa) 1, 4-kertaisella moolisuhteella 20 minuutin ajan. Ylimääräinen väriaine poistettiin geelisuodatuksella vaihtopuskuriin (alla), minkä jälkeen hydrofobinen imeytyminen Biobiediin (Bio-Rad) yön yli. Nimilippuun lisättiin 102% sy3-kalmoduliinia ja 75% sy5-kalmoduliinia. Aliquotit säilytettiin -80°C: ssa.
merkityn kalmoduliinin vaihto myosiini V: hen tapahtui kuvatulla tavalla, mutta joitakin muutoksia tehtiin (22). Myosiini V (150 nM) inkuboitiin 0, 7 nM Cy3-merkityllä kalmoduliinilla ja 0, 8 nM Cy5-merkityllä kalmoduliinilla vaihtopuskurissa (25 mM KCl/20 mM imidatsoli HCl, pH 7, 4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) 22°C: ssa 2 minuutin ajan. Kalmoduliinien vaihtamiseksi lisättiin 0,9 mM CaCl2 ja seosta inkuboitiin 22°C: ssa 5 minuutin ajan. Reaktio sammutettiin 7 mM: n EGTA: lla. Reaktioseos levitettiin 100k MWCO-nanosepän ultrasuodatuslaitteeseen (Pall) ja pestiin kolme kertaa yhtä suurella AB-tilavuudella (alla) myosiini V: n puhdistamiseksi ylimääräisestä kalmoduliinista.
Virtauskennojen Valmistus. Virtauskennossa oli lasimikroskoopin liukumäki ja nlaf21: stä (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) valmistetut erittäin taittuvat peitinkappaleet, joita Kaksipuolinen teippi piti koossa.
myosiini V-kokeissa 15 µl biotiini-BSA: Ta (1 mg·ml-1) inkuboitiin virtaussolussa 2 minuutin ajan, minkä jälkeen 30 µl AB-puskuria (25 mM KCl/25 mM imidatsoli-HCl, pH 7, 4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) johdettiin virtaussolun läpi sen huuhtelemiseksi. Soluun lisättiin viisitoista mikrolitraa, joissa oli 0,5 mg/ml Neutravidiinia (molekulaarisia koettimia) ja niiden annettiin inkuboitua 2 minuuttia, minkä jälkeen tehtiin toinen pesu AB-puskurilla. Virtauskennoa inkuboitiin 5 minuutin ajan 15 µl: lla biotinyloituja falloidiini-aktiinifilamentteja (250 nM), minkä jälkeen 100 µl: n pesu AB-puskurilla. Lopuksi soluun ladattiin 20 µl kuvantamispuskuria, mukaan lukien kalmoduliinilla vaihdettu myosiini V, 5 µM kalmoduliini, 300 nM ATP, ATP-regenerointijärjestelmä (0, 1 mg·ml-1 kreatiinifosfokinaasi/1 mM kreatiinifosfaatti) ja 0, 5% (vol/vol) Triton-X 100 epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. Kenno suljettiin tyhjiörasvalla ja kuvattiin välittömästi. Lopullinen motorinen konsentraatio johti niukasti koristeltuun aktiiniin ja mahdollisti siten yksittäisten myosiini V-molekyylien analysoinnin.
DNA-kokeissa biotiini-BSA ja Neutravidiini ladattiin samalla tavalla kuin myosiini V-kokeissa, mutta pesut tehtiin T50-puskurilla (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Kun virtauskennossa oli Neutravidiinipinnoite, 15 µlof dsDNA (30 nM) T50-puskurissa, jossa on 1 mg·ml-1 BSA, virtattiin sisään ja inkuboitiin 2 minuutin ajan, minkä jälkeen 100 µl kuvantamispuskuria virtasi sisään. Virtauskenno sinetöitiin sitten tyhjiörasvalla ja kuvattiin nopeasti. Tuloksena syntynyt DNA-molekyylien pinnanmuodostus oli sen verran harvaa, että eri molekyylien fluoresoivat kohdat harvoin limittyivät toisiinsa.
Mikroskoopin Asennus. Total internal reflection fluoresence (TIRF) – mikroskooppi otettiin käyttöön ref: ssä kuvatulla tavalla. 8, joitakin muutoksia (Kuva. 5, joka julkaistaan tukitietona PNAS-verkkosivustolla). Magnetointilähdesäteet 532 nm (koherentti, Santa Clara, CA) ja 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) yhdistettiin dikroisella peilillä ja laajennettiin halkaisijaltaan 7 mm: n suuruisiksi. Nämä lähteet kohdistettiin (polttoväli = 500 mm) Olympus 1.65 NA ×100 TIRF-kohteen takatarkennustasoon lineaarisella translaatiovaiheessa olevan laserlinjan avulla, joka mahdollistaa mikroskoopin käytön joko epifluoresenssissa tai TIRF-tilassa. Tavoite oli sijoitettu suljetun, kaksiakselisen piezo-nanotranslaatiovaiheen alle, joka oli varustettu kapasitiivisilla antureilla asennonmittausta varten (Physik Instrumente, Auburn, MA). Kohteen taka-aukosta poistuva heijastunut valo suunnattiin kvadranttivalodiodille antamaan signaali fokuksen takaisinkytkentäsilmukalle, joka kiinnitti kohteen ja näytteen välisen etäisyyden sähköstriktiivisellä toimilaitteella (Newport, Fountain Valley, CA). Objektiivi keräsi fluoresenssipäästöjä, kuljetti ne kahden Pysäytyslinjan ohutkalvosuodattimen (Semrock, Rochester, NY) läpi, yhden kutakin herätelähdettä kohti, ja välitti ne dual-view-laitteen kautta, joka mahdollisti Cy3-ja Cy5-kanavien samanaikaisen kuvantamisen yhdellä iXon DV 887 EMCCY-kameralla (Andor Technology, Belfast, Irlanti). Kaikki tiedot kuvattiin 0,5 sekunnin integraatioajalla. Ylikuuluminen kahden kanavan välillä (10%) oletettavasti harhauttaa etäisyysmittaukset kohti pienempiä arvoja. Kokeellinen virheemme tekee siitä kuitenkin huomaamattoman, kuten Monte Carlon simulaatiot osoittavat, joissa luotiin 100 paria mallinnettuja kuvia yksittäisistä fluoroforeista, jotka on erotettu toisistaan 10 nm: llä, ja analysoitiin identtisesti DNA-tietojen kanssa (kuvattu alla). Simuloidut kuvat loistepisteen leviämisfunktioista laskettiin generoimalla integroitu 2D-Gaussin intensiteettijakauma, jossa on jatkuva tausta, johon lisättiin ammuntamelu. Simuloiduilla huipuilla oli samat mitat ja signaali-kohina-suhde kuin todellisilla huipuilla. Simuloituja tietoja 10% ylikuulumisella ja simuloituja tietoja ilman ylikuulumisella ei voida erottaa Kolmogorov-Smirnov-testillä (N 1 = 100, n 2 = 100, p > 0, 05).
Data-Analyysi. Cy3-ja Cy5-kanavien rekisteröintikartoitus suoritettiin fiducialeilla, jotka koostuivat 100 nm: n Transfluosfäärihelmistä (Molekyyliluotaimista). Ne kiihtyivät 532 nm: ssä, ja ne säteilevät laajalla emissiospektrillä. Helmi oli havaittavissa molemmissa kanavissa. Löysimme yhden helmen, joka liittyy coverslipiin, ja piezo-vaiheen kanssa astuimme sen nanometrin tarkkuudella ruutukuvioon (0,5-µm: n väli), ottaen kuvan joka pysähdyksellä. Lopputuloksena oli 312 kuvan pino, jossa helmi näkyy molemmissa kanavissa eri asennoissa (Kuva. 1 A ).
DNA-aineisto analysoitiin kotitekoisella ohjelmistolla MATLABin (Mathworks, Natick, MA) avulla. Rutiini paikantaa automaattisesti kuvassa olevat huiput määrittämällä korkean intensiteetin Pikselit ja varmistaa, että ympäröivillä pikseleillä on odotetut intensiteetit yksittäiselle fluoriforille. Ennen piikkien sovittamista 2D – Gaussin funktioon sen keskipisteiden saamiseksi etsimme pareittain huippuja. Cy5-kanavalta löydetyt Pikselit kartoitetaan Cy3-kanavalle ja etsitään piikkejä ympäröivistä Cy3-pikseleistä. Jos piikki löytyy, niin Cy5-piikki ja Cy3-piikki katsotaan pariksi tarkempaa analyysiä varten. Jokainen piikki sopii 2D Gaussin funktioon sen vastaavassa tilassa, kuten on kuvattu yllä oleville helmille (Eq. 1 ). Fit – keskiarvon paikkavirhe lasketaan kerättyjen fotonien (Ny) määrällä, 
Cy5: n sijainti kartoitetaan Cy3-kanavalle ja niiden välinen etäisyys lasketaan. DNA-aineiston laskennallisen analyysin jälkeen tunnistetut fluoriforiparit seulottiin käsin, jotta voitiin varmistaa, etteivät ne olleet lähellä muita fluoriforeja, jotka olisivat häirinneet parien analyysia.
myosiini V-aineisto analysoitiin tunnistamalla ensin liikkuva Moottori silmämääräisesti. Matlabiin kirjoitettu Kotitekoinen ohjelmisto sovitti sitten fluoresoivien piikkien aloitusparin 2D Gaussin toimintoihin edellä kuvatulla tavalla ja jatkoi piikkien seuraamista niin kauan kuin käyttäjä on määritellyt. Moottorit, joiden konjugoidut väriaineet valotettiin yhdessä vaiheessa, analysoitiin, kuten useimpien Havaittujen moottoreiden tapauksessa, mikä varmisti, että tutkimme todellakin moottoreita, joissa oli vain yksi Cy3-merkki ja yksi Cy5-merkki. Tuloksena syntyneet liikeradat rekisteröitiin kartoittamalla Cy5: n lentorata Cy3: n kanavalle. A pienimmän neliösumman lineaarinen sovi kohtia molemmista trajectories antoi suunta, aktin hehkulangan, johon trajectories olivat ennustetaan. Etäisyydet lineaarisen sovituksen (aktiinifilamentin) suuntaisesti piirrettiin aikaa vasten, jotta voitiin nähdä päiden suhteelliset etäisyydet (Kuva. 4).
Aikajälki, jossa eri tavoin merkitty myosiini V-molekyyli kävelee aktiinifilamenttia pitkin. Merkit (Cy3 ja Cy5) on kiinnitetty kovalenttisesti kalmoduliineihin, jotka vaihdettiin myosiini V-molekyyliin. Tässä jäljityksessä molemmat loisteluotaimen sijainnit ottavat 72 nm: n askelia, mikä osoittaa, että kalmoduliinit vaihtuivat lähellä moottorialuetta. Luotainten vaihtuvat asennot antavat suoran havainnon myosin V: n käsi-yli-käsikävelymekanismista.