Proteiinikinaasit ovat suurin solusignaalien transduktioon osallistuva entsyymiyliherkkyysperhe ja edustavat terapeuttisia tavoitteita useille sairauksille. Monissa laboratorioissa on ponnisteltu kovasti niiden katalyyttisten mekanismien ymmärtämiseksi, inhibiittorien löytämiseksi ja solutoimintojen havaitsemiseksi. Tässä katsauksessa kuvataan kaksi lähestymistapaa, jotka on kehitetty analysoimaan proteiinikinaaseja: bisubstrate analoginen esto ja fosfonaatti analoginen hyödyntäminen. Kumpaakin näistä menetelmistä on käytetty yhdessä proteiinisynteesin ilmentämän proteiinisidoksen kanssa kinaasi-substraatti-vuorovaikutusten ja fosforylaation funktionaalisen selvittämisen edistämiseksi. Aikaisempi proteiinikinaasimekanismin luonnetta koskeva työ viittaa siihen, että se seuraa dissosiatiivista siirtymätilaa. Bisubstraattianalogi suunniteltiin insuliinireseptorikinaasia vastaan jäljittelemään dissosiatiivisen siirtymätilan reaktiokoordinaattietäisyyden geometriaa. Tämä bisubstraattiyhdiste osoittautui voimakkaaksi estäjäksi insuliinireseptorikinaasia vastaan ja sitoutui sekä peptidiin että nukleotidiin. Bisubstraattiyhdisteet, joilla on muuttunut vetysidospotentiaali sekä vaihtelevat välilevyt adeniinin ja peptidin välillä, osoittavat alkuperäisen rakenteen tärkeyden. Olemme myös osoittaneet, että niihin liittyviä bisubstraattianalogeja voidaan käyttää voimakkaasti estämään seriini/treoniinikinaaseja, mukaan lukien proteiinikinaasi A. Koska monet proteiinikinaasit tunnistavat Taitetut proteiinisubstraatit tehokkaaksi fosforylaatioksi, peptidi-ATP-konjugaattien liittäminen proteiinirakenteisiin oli edullista. Ilmentyvän proteiinin ligaation avulla tuotettiin Src-ATP-konjugaatti, jonka osoitettiin olevan korkean affiniteetin ligandi Csk-tyrosiinikinaasille. Fosfoseerin/fosfotyyrin hydrolysoitumattomista jäljittelyistä voi olla hyötyä tutkittaessa fosforylaatiotapahtumien toimivuutta. Käyttämällä ilmentyvän proteiinin ligaatiota olemme käyttäneet fosfonometyleenifenyylialaniinia ja fosfonometyleenialaniinia Tyrin ja Ser: n fosforylaation tutkimiseen. Nämä työkalut ovat mahdollistaneet SH2-fosfataasien (SHP1 ja SHP2) analysoinnin, mikä paljasti vastaavien fosforylaatiotapahtumien välittämän katalyyttisen aktiivisuuden uudenlaisen intramolekulaarisen stimulaation. Niitä on käytetty myös kuvaamaan melatoniinirytmientsyymin solujen säätelyä fosforylaation avulla.