La loi de Poisson, du nom du mathématicien français Siméon Denis Poisson, est la probabilité d’occurrence d’un nombre donné d’événements dans une période de temps donnée (fixe) si les événements se produisent à un rythme constant (connu) et sont indépendants de l’occurrence de l’événement précédent. Il est basé sur une distribution de probabilité discrète, où l’ensemble des résultats sont discrets ou finis, comme le lancer d’une pièce de monnaie ou un jet de dés.
Dans le cadre d’une expérience de PCR numérique, les résultats discrets sont la présence ou l’absence du gène cible. Les milliers de partitions individuelles produites pour une réaction de PCR numérique devraient suivre une distribution de poisson étant donné que les partitions sont monodispersées et qu’elles contiennent le volume équivalent du mélange d’échantillons.
Si ces paramètres ne sont pas respectés et que les partitions présentent une polydispersité, le volume de mélange d’échantillons dans les partitions variera largement et les partitions plus grandes peuvent contenir plus de cibles que les plus petites, ce qui diminue la précision de la réaction de PCR numérique.
Dans cet article, nous vous guidons à travers le calcul mathématique de la loi de Poisson pour une expérience de PCR numérique.
Pour une expérience de PCR numérique, un puits contenant l’échantillon partitionné d’intérêt et un gène cible à quantifier, nous devons d’abord définir les variables suivantes:
- \( N\) : nombre total de partitions analysables dans le puits
- \(p\) : nombre de partitions positives pour le gène cible
- \(v\) : volume de la partition (en µL), supposé constant
- \(d\) : facteur de dilution utilisé pour diluer l’échantillon du stock vers le puits
( par exemple, \(d = 10\) signifie que l’échantillon a été dilué 10 fois)
et ensuite ces autres:
-
\( V = N\v\) : volume total de partition injecté dans le puits
-
\( C_ {0}\) : concentration des gènes cibles dans le puits (en copies/µL)
-
\( C = d\C_{0}\) : concentration des gènes cibles dans le stock (en copies/µL)
-
\(\ lambda=C_{0}\v\) : nombre moyen de gènes cibles par partition dans le puits
La distribution des gènes cibles encapsulés dans les partitions du puits suit une distribution de Poisson du paramètre \(\lambda\) :
Proba(partition encapsule \(\text{kk}}\) gènes cibles)\(=\dfrac{\lambda^k}{k!}e^{-\lambda}\)
Une partition est dite:
-
» Partition positive » si elle a encapsulé au moins 1 gène cible (auquel cas nous observerons une partition fluorescente au point final du processus d’amplification, donc la majeure partie de l’incertitude réside dans cette « au moins une » condition)
-
» Partition négative » si a encapsulé 0 gène cible (auquel cas nous observerons une partition non fluorescente au point final du processus d’amplification)
La distribution des partitions positives dans le puits suit une distribution binomiale de probabilité \(1 – e ^ {-\ lambda}\):
- Probabilité (contient bien \(\text {pp}}\) partitions positives \(= {\rm C} _{N}^{p}(1-e^{-\lambda}) ^p(e^{-\lambda}) ^{N-p} \)
- Probabilité (la partition est négative) \(=e^{-\lambda}\)
- Probabilité (la partition est positive) \(= 1–e^{-\lambda}\} \)
Si \(N\) est suffisamment grand:
- Proba(partition est positive) \(= \dfrac{p}{N} \)
La formule de la concentration estimée du stock est donc la suivante:
\(C=-\dfrac{d}{v}\ln {\left(1-\dfrac{p}{N}\right)} \)
Si vous avez besoin de calculer automatiquement les concentrations estimées de gènes cibles, ainsi que leur intervalle de confiance et leur incertitude relative, un outil en ligne est disponible : Loi de Poisson: Aller plus loin. Essayez!
Pour plus d’informations sur les courbes d’incertitude, ainsi que sur les limites de détection et de quantification, veuillez consulter l’item: Plages dynamiques de détection & Quantification.