Hemoglobin affinitás az oxigénhez a varangyok három alfajában (Bufo sp.) élő különböző magasságokban
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA Cifuentes 3
1 Clinicum Laboratorio Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratorio de Transporte de Oxgeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, per 6
3 Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
absztrakt
a vér oxigén affinitását és vörösvérsejt tulajdonságait a Bufo nemzetség három alfajában mértük: bufo spinulosus limensis, tengerszinten és 20 Ca átlagos napi hőmérsékleten gyűjtötték; Bufo spinulosus trifolium, 3100 m-től, az átlagos napi hőmérséklet 15 CA; és Bufo spinulosus flavolineatus, 4100 m-től, az átlagos napi hőmérséklet 10 CAC. A hemoglobin elektroforézise ugyanazt a komponenst mutatta a három alfaj mindegyikében. A vér oxigén affinitása (P50) a 20. O. O. – nál kis eltéréseket mutatott a Bufo spinulosus limensis és a Bufo spinulosus trifolium között, míg a Bufo spinulosus flavolineatus értéke jelentősen alacsonyabb volt. A Bufo spinulosus flavolineatus környezeti hőmérséklete 10 oC-nál a P50 rendkívül alacsony volt a másik két alfajhoz képest a megfelelő környezeti hőmérsékleten.
kulcsszavak: adaptációk, magasság, kétéltűek, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, hemoglobin affinitás, hematokritok, oxigénkötés, varangyok
bevezetés
Peruban a Bufo nemzetség tengerszint feletti magassági gradienst foglal el, amely a tengerszinttől 4000 m felett van. A Bufo spinulosus fajnak három alfaja van, amelyek fülkéi alacsony, közepes és nagy magasságban vannak. Ezek az alfajok a Bufo spinulosus limensis (alacsony magasság), a Bufo spinulosus trifolium (közepes magasság) és a Bufo spinulosus flavolineatus (nagy magasság) (12). A gerincesek légzőrendszerének egyik legintenzívebben vizsgált környezeti adaptációja a hipoxia, amely különféle módon fordul elő nagy magasságban, embrionális fejlődésben (például méhen belül) és vízi, különösen édesvízi környezetben. Ezek az adaptációk általában magukban foglalják a vörösvértestek tulajdonságainak, az oxigénszállító képességnek vagy a hemoglobin oxigén affinitásának változását. Az intraspecifikus adaptációk, amelyek ugyanabban az állatban különböző körülmények között fordulnak elő, általában az alloszterikus tényezők (azaz azok a körülmények, amelyek között a hemoglobin a vörösvértestekben működik) megváltozásával járnak, míg az interspecifikus adaptációk, amelyek nyilvánvalóak a különböző fajok összehasonlításakor, a hemoglobin molekulák tulajdonságainak változásainak tulajdoníthatók.
a vörösvértestek és a hemoglobin tulajdonságainak hipoxiás adaptációjával kapcsolatos legtöbb tanulmány halakra és emlősökre vonatkozik, és nagyon keveset tudunk az alacsonyabb ektoterm gerincesekről. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a Telmatobius culeus (2) tó Titicaca béka 3800 m-en él. magasabb vér O2 affinitással és kisebb vérsejtekkel rendelkezett, mint a tengeri békák. Ez a tanulmány a Bufo alfaj adaptációit írja le.
anyag és módszerek
a Bufo spinulosus limensis alfajba tartozó Anuránokat a limai laboratóriumunktól kb. 400 km-re lévő part menti síkságokról gyűjtöttük össze (tengerszint, átlagos napi hőmérséklet 20 ft). A Bufo spinulosus trifoliumot a Közép-perui Andokban gyűjtötték (kb. 3100 m, átlagos napi hőmérséklet 15 oc), és a Bufo spinulosus flavolineatus-t szintén a Közép-Andokban (4100 m, átlagos napi hőmérséklet 10 oc). Az állatokat néhány órán belül laboratóriumunkba vitték. A vért heparinizált fecskendőkben vették a korábban kivágott állatok szívéből. A Bufo spinulosus limensis-ből körülbelül 3 ml, a többi alfajból pedig 1-1, 5 ml vér nyerhető. A meghatározások elvégzéséhez két-három állat vérét egyesítettük. A vörösvérsejtszámot, a hemoglobin koncentrációt és a hematokritokat hagyományos módszerekkel mértük.
a hemoglobin elektroforézisét cellulóz-acetát csíkokon végeztük egy hemoglobin elektroforézisre specifikus pufferben, és a sávokat Ponceau S-vel festettük, és a Helena Laboratories (USA) használati útmutatója szerint denzitométerben olvastuk.
a vér-oxigén affinitást (P50) keverési technikával (1,10) mértük 10, 15, illetve 20 CAC-on. A véregyensúlyt ezen a hőmérsékleten tartott tonométerben 4,5% CO2-t és változó O2-és N2-koncentrációt tartalmazó gázkeverékekkel végeztük. A vér O2 telítettsége 30-80% között változott. A pH-mérőt nagy pontosságú foszfátpufferekkel kalibráltuk.
az egyensúlyi hőmérsékletek (EQ) pH-értékeit a mérési hőmérsékletek (meas) értékeiből számítottuk ki a Rosenthal (8) által megadott egyenlet segítségével:
pHeq = pH meas + 0,0147 (Teq _ Tmeas)
a Bohr-tényezőt a vér pH-jának az alábbiak szerinti megváltoztatásával kaptuk. A vér alikvotokból előállított plazmát vagy tejsavval megsavanyítottuk, vagy nátrium-hidroxiddal lúgosítottuk, majd a megfelelő vörösvérsejtekkel feloldottuk. A Bufo spinulosus limensisből és a Bufo spinulosus trifoliumból származó vérmintákat 20 (15) a Bufo spinulosus flavolineatusból származó vérmintákat 20 (10) az egyes hőmérsékletekre vonatkozó Bohr-tényező kiszámítása céljából egyensúlyba hoztuk (14). Ez a tényező lehetővé tette a standard vér pH kiszámítását a három hőmérsékleten. A Hill együtthatójának (n) kiszámításához egymást követő közelítések módszerét használtuk (10). Az egyes alfajok Bohr-egyenletének értékét külön kísérletek adataiból számítottuk ki.
a van ‘t Hoff-egyenletet használtuk az oxigénezés teljes hőjének kiszámításához DH’ a P50 értékekből. A Bufo spinulosus limensis esetében a környezeti hőmérséklet 20, illetve 15 CA-nál 20 CA-t vett figyelembe. A Bufo spinulosus trifolium esetében a környezeti hőmérséklet 15, illetve 20 CA-nál 15 oC-ot vett fel. A Bufo spinulosus flavolineatus esetében a környezeti hőmérséklet 10, illetve 20 ca (10 CA) volt. A statisztikai szignifikanciát a Student t tesztje határozta meg a Systat 6.0 for Windows szoftverrel.
eredmények
az I. és II.táblázat összefoglalja a hematológiai adatokat. Nincs statisztikai különbség a Bufo spinulosus limensis és a Bufo spinulosus trifolium értékei között. A Bufo spinulosus flavolineatusban a hematokrit, a hemoglobin és a vörösvértestek mennyisége sokkal alacsonyabb.
az elektroforézis kísérletek azonos vándorlási távolságokat mutattak a három alfaj hemoglobinjaiban, valamint két sáv jelenlétét néhány futásban (ábra. 4). A hemoglobin tulajdonságainak meghatározására további vizsgálatokat nem végeztek.
a II.táblázat a vérben lévő hemoglobin funkcionális tulajdonságait mutatja, kis különbségeket mutatva a P50-ben a Bufo spinulosus limensis és a Bufo spinulosus trifolium között, míg a Bufo spinulosus flavolineatus értéke alacsonyabb. A környezeti hőmérsékleten mért értékek, ahol az állatokat gyűjtötték, nem különböztek szignifikánsan a Bufo spinulosus limensis és a Bufo spinulosus trifolium között. A Bufo spinulosus flavolineatus esetében 10 CA-nál a P50 érték nagyon alacsony. Az 1. ábra a Log P50 vs. pH diagramját mutatja. A 2.ábra a P50 és a Hill-együttható értékeivel felépített hemoglobin oxigén disszociációs görbéket mutatja 20 C-on. a Bufo spinulosus limensis és a Bufo spinulosus trifolium görbéi nagyon közel vannak egymáshoz, míg a Bufo spinulosus flavolineatus görbéi balra tolódnak. A 3. ábra az egyes alfajok környezeti hőmérsékletén mért vér O2-tartalom vs.vér PO2-tartalma. Ez a Bufo spinulosus flavolineatus alacsony O2-és nagyon alacsony P50-tartalmát mutatja, valamint a Bufo spinulosus trifoliumtól balra mérsékelt elmozdulást mutat a Bufo spinulosus limensishez képest, a Bufo spinulosus limensis és a Bufo spinulosus trifolium vér O2-tartalmának csökkenése nélkül.
Fig. 1: Bohr-hatás a Bufo spinulosus három alfajában. A Bufo spinulosus flavolineatus mutatja a legnagyobb Bohr-faktort.
Fig. 2: A három alfaj Vérdisszociációs görbéje 7,84-es és 20 C-es pH-értéknél. A Bufo spinulosus flavolineatus görbéje balra tolódik.
Fig. 3: Hemoglobin O2 tartalom vs részleges oxigénnyomás az egyes alfajok esetében a megfelelő ökológiai hőmérsékleten. Bufo spinulosus limensis (20 stb.), Bufo spinulosus trifolium (15 Kb.) Bufo spinulosus flavolineatus (10 KB.). A Bufo spinulosus flavolineatus hemoglobintartalma alacsonyabb, mint a másik két alfajban, a P50 pedig nagyon alacsony.
Fig. 4: A Bufo Spinulosus három alfajának elektroforézise. A kísérlet azonos vándorlási távolságokat mutat a három alfaj hemoglobinjaiban, valamint két sáv jelenlétét néhány futásban.
ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Bufo spinulosus flavolineatus, amelynek természetes élőhelye közel 4000 m, és amelynek környezeti hőmérséklete átlagosan 10 6C, alacsony hemoglobin-tartalommal és magas hemoglobin-affinitással rendelkezik, összehasonlítva a Bufo spinulosus trifoliummal, amelynek átlagos környezeti magassága közel 3000 m, és amelynek környezeti átlaghőmérséklete 15 6C. A Bufo spinulosus limensis (tengerszint) és a Bufo spinulosus trifolium szinte azonos görbékkel rendelkezett. Ha a görbéket környezeti hőmérsékleten kaptuk, a Bufo spinulosus flavolineatus nagyon alacsony O2-tartalmat és magas hemoglobin-affinitást mutatott a másik két alfajhoz képest. A Bufo spinulosus flavolineatus esetében a magas DH ‘ a hemoglobin affinitásának nagy érzékenységét jelzi a környezeti hőmérséklet változásaival szemben, a magas Bohr faktor pedig a hemoglobin affinitásának nagy érzékenységét jelzi a vér pH-jának változásaival szemben.
vita
a Bufo nemzetség elterjedt az Andok országokban. A Bufo spinulosusnak három alfaja van, amelyek fülkéi az Andok alsó lejtőin, a köztes völgyekben (3000 m) és a legmagasabb síkságon (4000 m felett) helyezkednek el. A közepes magasságú Bufo spinulosus trifolium alfaj és a tengerszint feletti magasságú Bufo spinulosus limensis alfaj hematológiai értékei nem különböznek egymástól. A nagy magasságú Bufo spinulosus flavolineatus sokkal alacsonyabb hemoglobinkoncentrációval rendelkezik, de a vörösvértestek jellemzői hasonlóak a másik két alfajhoz. Úgy tűnik, hogy a vörösvérsejtek kisebbek, mint a másik két alfajé, ellentétben Ruiz (9) megállapításaival, amelyek az ellenkezőjét jelezték. Ismeretes, hogy a Bufo nemzetség magasabb hemoglobin-koncentrációval rendelkezik, mint más kétéltűek. Hutchinson és Szarki (3) Ezt a magas vaszkularizációnak és a földi szokásnak tulajdonítják. A Bufo spinulosus flavolineatus azonban nagyon alacsony hemoglobinkoncentrációval rendelkezik.
a három csoportban a hemoglobin elektroforetikus vizsgálat olyan személyeket mutat be, akiknek elektroforetikus mintája két egyértelműen különálló hemoglobin sávot mutat. A Bufo spinulosus Trifolium és a Bufo spinulosus limensis között nincs különbség a hemoglobin affinitásában 20 CA-nál, míg a Bufo spinulosus flavolineatus esetében ez magasabb. Amikor az affinitásokat az állatok környezeti hőmérsékletén tanulmányozták, a Bufo spinulosus trifolium oxigén disszociációs görbéi mérsékelten eltolódtak a Bufo spinulosus limensis-től balra, a Bufo spinulosus flavolineatus pedig nagyon markáns eltolódást mutatott, ami nagyon magas hemoglobin affinitást mutatott.
nagy magasságban az őshonos emlősök és madarak általában magas vér oxigén affinitással rendelkeznek, és nem mutatnak polycythemiát nagy magasságban (5). Érdekes lenne megfigyelni, hogy ezek a környezeti hipoxiára és hideg állapotokra adott válaszok jelen vannak-e az ektoterm állatokban. Elméletileg a hideg körülményeknek hozzá kell járulniuk a nagy magasság toleranciájának növeléséhez, mivel ez csökkenti az anyagcserét. A Bufo spinulosus flavolineatus esetében, amelynek napi hőmérséklete a sziklák alatt 4100 m-en körülbelül 10, éjjel pedig körülbelül 6, vagy annál kevesebb a tavakban, ahol félig elmerülnek, a nagy affinitás a hipoxia felé mutató szelekciós nyomást jelzi az anyagcsere sebességének esetleges csökkenése ellenére. Packard és Stiverson (7) nem találtak kapcsolatot a magasság és a hemoglobin koncentráció között a kórusbéka (Pseudacris triseriata) esetében, de tanulmányukban a magasságtartomány (1500 m és 3000 m) kicsi volt.
a hemoglobin affinitás egy genetikai jel, amelyet nyilvánvalóan a gerincesek hipoxiás környezete választott ki. Emlősökben és madarakban az affinitás egy meglehetősen rögzített tulajdonság, amely nem növekszik a hipoxiában, és nem tűnik el a normoxiában (6). A halakban viszont a vér oxigénje jelentősen növekszik hipoxia alatt (13).
összehasonlító szempontból van néhány hasonlóság az ektotermák és az endotermák között. Megállapították, hogy van némi összefüggés a hemoglobin affinitás és a magasság között a magassági gradienst elfoglaló egerek alfajaiban (11). Azt is kimutatták, hogy ugyanazon emlősfajokon belül, amelyek az Andokban függőleges gradiens mentén élnek, a legmagasabb tartományban élő egyének hemoglobinjai nagyobb affinitással rendelkeznek, mint a legalacsonyabb tartományban élő egyének. Ezek a különbségek nagyobbak voltak az andoki róka esetében, ahol két különálló faj foglalja el a magassági tartomány két szélsőségét (4).
ez a munka megerősíti azt a koncepciót, hogy a policitémiát nem választják adaptív paraméterként a hipoxiás környezethez. Éppen ellenkezőleg, úgy tűnik, hogy a nagy affinitású hemoglobin erősen kiválasztódik a nagy magasságban élő különféle állatokban.
köszönetnyilvánítás
köszönjük Dr. Roy E. Weber segítségét a témával kapcsolatos gondolkodásunk tisztázásában és a kézirat áttekintésében.
Megfelelő Szerző: Hrvoj Ostojic P. – Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Telefon: (56-57) 420599, Fax: (56-57) 427683, e-mail: [email protected]
kapott: augusztus 13, 1999. Elfogadott módosított formában: május 6, 2000
bibliográfia
1. EDWARDS MJ, MARTIN RJ (1966). Keverési technika az oxigén-hemoglobin egyensúly és a Bohr hatás eléréséhez. J Appl Physiol 21:1898-1902
2. HUTCHINSON VH, HAINES HB, ENGEBRETSON G (1976) vízi élet nagy magasságban: légzési adaptációk a Titicaca-tóban béka, Telmatobius culeus. Respir Physiol 2:115-119.
3. Hutchinson VH, SZARSKI H (1965) az eritrociták száma néhány kétéltűben és hüllőben. Copeia: 373-375
4. LEON-VELARDE F, de MUIZON C, PALACIOS JA, CLARK D, MONGE-C C (1996) Hemoglobin affinitás és szerkezet Peru nagy magasságú és tengeri szintű húsevőiben. Comp Biochem Physiol 113a:407-411
5. MCCUTCHEON FH HALL FG (1937) Hemoglobin a Kétéltűben. J-Sejt & Comp Physiol 9:191-197
6. MONGE C, LEON-VELARDE F (1991) fiziológiai alkalmazkodás a nagy magassághoz: oxigénszállítás emlősökben és madarakban. Physiol Rev 71: 1135-1172
7. PACKARD G C STIVERSON RK (1976) vér hemoglobin koncentrációja kórus béka (Pseudacris triseriata): kapcsolat a test méretével és magasságával. Am Midl Nat 96: 482-487
8. ROSENTHAL TB (1948) a hőmérséklet hatása a vér és a plazma pH-jára in vitro. J Biol Chem 173:25-30
9. RUIZ G, ROSENMANN M, VELOSO A. (1989) magassági Eloszlás és vérértékek a varangyban, Bufo spinulosus Wiegmann. Comp Biochem Physiol 94A: 643-646
10. SCHEID P, MEYER M (1978) keverési technika az oxigén-hemoglobin egyensúly tanulmányozásához: kritikus értékelés. J Appl Physiol 45: 818-822
11. SNYDER GK, BLACK CP, BIRCHARD GF (1982) fejlődés és anyagcsere során hypoxia embriók nagy magasságban Anser indicus versus tengerszint Branta canadensis liba. Physiol Zool 55:113-123
12. VELLARD J (1959)Estudios sobre batracios andinos V: el G. D. N. Bufo. NAT Javier Prado Mem Hist N 6
13. WEBER RE (1992) molekuláris stratégiák a gerinces hemoglobin funkció adaptációiban: WOOD SC, WEBER RE, HARGENS AR, MILLARD RW (eds) Fiziol adaptációk gerincesekben, New York: Marcel Dekker
14. WINSLOW RM, MORRISSEY JM, BERGER RL, SMITH PD, GIBSON CC (1978) a normál vér oxigén affinitásának változékonysága: automatizált mérési módszer. J Appl Physiol: Respirat Environ Gyakorlat Physiol 45(2): 289-297