a Poisson-eloszlás, amelyet a francia matematikusról neveztek el Sim Oncon Denis Poisson, egy adott számú esemény előfordulásának valószínűsége egy adott (rögzített) időszakban, ha az események állandó (ismert) sebességgel fordulnak elő, és függetlenek az előző esemény előfordulásától. Diszkrét valószínűségi eloszláson alapul, ahol az eredmények halmaza diszkrét vagy véges, például egy érme dobása vagy dobás.
digitális PCR-kísérlet összefüggésében a diszkrét eredmények a célgén jelenléte vagy hiánya. A digitális PCR-reakcióhoz előállított több ezer egyedi partíció várhatóan Poisson-eloszlást követ, figyelembe véve, hogy a partíciók monodiszperzeltek, és a mintakeverék ekvivalens térfogatát tartalmazzák.
ha ezek a paraméterek nem teljesülnek, és a partíciók polidiszperzitást mutatnak, a partíciók mintakeverékének térfogata nagymértékben változik, és a nagyobb partíciók több célt tartalmazhatnak, mint a kisebbek, csökkentve a digitális PCR reakció pontosságát.
ebben a tételben bemutatjuk a Poisson-törvény matematikai kiszámítását egy digitális PCR-kísérlethez.
egy digitális PCR kísérlethez, egy kúthoz, amely tartalmazza a kérdéses particionált mintát, valamint egy célgént a számszerűsítéshez, először meg kell határoznunk a következő változókat:
- \(N\): a kútban elemezhető partíciók teljes száma
- \(p\): a célgén pozitív partícióinak száma
- \(v\): a partíció térfogata (Ft-ban), feltételezve, hogy állandó
- \(d\): a minta hígítására használt hígítási tényező az állományból a kútba
(\(d=10\) azt jelenti, hogy a mintát 10-szer hígítottuk)
, majd ezek a további:
-
\(V = N \ v\): a kútba befecskendezett partíció teljes térfogata
-
\(C_{0}\) : a célgének koncentrációja a kútban (kópiákban / 6L)
-
\(C = d \ C_{0}\): a célgének koncentrációja az állományban (kópiákban / 6L)
-
\(\lambda = C_{0} \ v\): A célgének átlagos száma partíciónként a kútban
a kút partícióiban kapszulázott célgének eloszlása a \(\lambda\) paraméter Poisson-eloszlását követi:
Proba (a partíció beágyazza \(\text{$k$}\) célgéneket) \(=\dfrac {\lambda^k}{k!} e^{- \lambda}\)
egy partíciót mondanak:
-
“pozitív partíció”, ha legalább 1 célgént kapszulázott( ebben az esetben fluoreszcens partíciót fogunk megfigyelni az amplifikációs folyamat végpontján, tehát a bizonytalanság nagy része ebben a “legalább egy” állapotban rejlik)
-
“negatív partíció” ha 0 célgént kapszulázott (ebben az esetben nem fluoreszcens partíciót fogunk megfigyelni az amplifikációs folyamat végpontján)
a pozitív partíciók eloszlása a kútban a valószínűség binomiális eloszlását követi \(1 – e^{- \lambda}\):
- valószínűség (jól tartalmaz \(\text{$p$}\) pozitív partíciókat \(= {\RM C}_{N}^{P} (1 – e^{-\lambda})^p (e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- valószínűség (partíció negatív) \( = e^{-\lambda} \)
- valószínűség (partíció pozitív) \( = 1 – e^{-\Lambda} \)
ha \(N\) elég nagy:
- Proba (partíció pozitív) \ (=\dfrac{p}{N} \)
tehát a becsült állománykoncentráció képlete:
\ (C = – \ dfrac{d}{v} \ ln {\left (1- \ dfrac{p}{N} \ right)} \)
ha automatikusan ki kell számolnunk a célgének becsült koncentrációját, a konfidencia intervallummal és a relatív bizonytalansággal együtt, egy online eszköz áll rendelkezésre: Poisson-törvény: tovább. Próbáld ki!
a bizonytalansági görbékkel, valamint a kimutatás és a számszerűsítés határaival kapcsolatos további információkért lásd: dinamikus kimutatási tartományok & számszerűsítés.