Rapporti oncologici

Introduzione

Il cancro polmonare è un tumore maligno con la più alta morbilità e mortalità in tutto il mondo e la sua incidenza Circa l ‘ 80% della malattia può essere attribuito acancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC) (1). A causa delle limitazioni delle prime tecniche diagnostiche e della mancanza di specifiche manifestazioni cliniche precoci, il 70-80% dei pazienti viene diagnosticato in stadi avanzati(2). Pertanto, l’identificazione di un trattamento farmacologico asafe ed efficace per NSCLC è fondamentale.

Recenti scoperte hanno dimostrato che l’incidenza,lo sviluppo e il trasferimento di NSCLC non sono solo influenzati da fattori genetici, ma che anche il cambiamento epigenetico è importante,incluso l’RNA non codificante a piccole molecole (ncRNA) (3). microRNA(miRNA), una classe di endogenopiccolo ncRNA con una lunghezza di ~21-25 basi, ampiamente esistenti ineucarioti, in grado di identificare l’mRNA di un gene target specifico (4). Oltre il 50% dei geni miRNA sono mappati in siti fragili o regioni genomiche correlate all’NSCLC,suggerendo che l’espressione di miRNA può essere strettamente associata all’NSCLC. Come riportato, l’espressione di un gran numero di miRNAs inNSCLC mostra disordine e lo squilibrio di miRNAs promuovere theprogression del ciclo cellulare NSCLC, effetto anti-apoptotico, enhancedcell invasione e metastasi del cancro del polmone non a piccole cellule(5).

La via di segnalazione PI3K / Akt svolge un ruolo importante nella sopravvivenza cellulare mediata dal fattore di crescita. Precedenti rilevazionihanno dimostrato che il disturbo della via PI3K/Akt/mTOR può giocare un ruolo importante nella formazione di NSCLC (6). È stato anche riferito che il segnale di proliferazione cellulare generato dalla combinazione di un certo numero di recettori e ligandi della trasmembrana può attivare la trasmissione del segnale di PI3K/Akt/mTOR, che è strettamente associato allo stato di proliferazione e sopravvivenza del CNSCLC (7). Questi recettori includono c-met,recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), c-kit e recettore del fattore di crescita insulino-simile (IGF-IR).

La curcumina è un principio attivo naturale estratto dal rizoma secco della pianta del genere Curcuma Curcuma, curcuma andCurcuma, con ampi effetti farmacologici, bassa tossicità e buona tolleranza e, grazie al suo valore economico, è diventato un hotspot per l’esplorazione (8). La ricerca di studi incentrati sulla curcumina ha identificato una vasta gamma di attività farmacologiche come anti-infiammazione,anti-ossidazione, lipidi, anti-virus, anti-infezione, antitumorale,anticoagulante, fibrosi anti-epatica e aterosclerosi, bassa tossicità e pochi effetti collaterali (9-13).Tuttavia, l’effetto della curcumina su NSCLC e il meccanismo sottostante rimane poco chiaro. Nel presente studio, abbiamo esaminato l’effetto antitumorale della curcumina sulla proliferazione cellulare e l’apoptosi del NSCLC umano e abbiamo identificato una possibile relazione tra questo effetto e la via di segnalazione PI3K/Aktsignaling modulata da miRNA-192-5p.

Materiali e metodi

Sostanze chimiche

Il mezzo di Eagle modificato (DMEM) e il siero fetalcalf (FBS) di Dulbecco sono stati acquistati da Gibco (Carlsbad, CA, USA) e(Sud America). il 3-(4,5-Dimetil-tiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio bromuro(MTT) è stato acquistato da Sangon Biotech (Shanghai, Cina). Il kit di rilevamento dell’apoptosi è stato acquistato DABD Biosciences (San Jose, CA, USA). Il test di attività caspase-3kit è stato acquistato da Promega (Madison, WI, USA).

Coltura cellulare

Cellule epiteliali polmonari normali NCL-H460 e BEAS-2E umane e cellule tumorali polmonari A549 umane sono state ottenute dal Centro CellResource della Seconda Università medica militare. Thesecells sono state coltivate in DMEM integrato con 10% FBS (entrambi fromGibco), 100 U/ml penicillina e 100 µg/ml streptomicina a 37°C e un incubatore humidifid con 5% CO2. Sono state esaminate le concentrazioni (5,10,20 e 40 µM) e i periodi di tempo (12 e24 h) di curcumina rispetto alle cellule A549. La struttura chimica della curcumina è mostrata in Fig.1.

Analisi della vitalità cellulare

Le cellule sono state seminate a una densità di5×103/pozzetto in piastre a 96 pozzetti. In breve, la viabilità cellulare è stata misurata con il test MTT (Sangon Biotech). Dieci microlitri MTT (5 mg/l) sono stati aggiunti in ciascun pozzetto e incubati per 4 ore a 37°C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2. Dimetilsolfossido(150 µl; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) sono stati aggiunti a ciascun pozzo e agitati per 20 min a temperatura ambiente. L’assorbanza è stata misurata a 450 nM utilizzando il lettore amicroplate.

Annexin V-FITC/propidium iodide (PI)analisi dell’apoptosi

Le cellule sono state seminate a una densità di1×106 / pozzetto in piastre a 6 pozzetti. Le cellule coltivate sono state lavate due volte con PBS ghiacciato e poi colorate con Annexin V-FITC e utilizzando il kit di rilevamento dell’apoptosi I secondo le istruzioni del produttore (BD Biosciences). L’apoptosi è stata analizzata tramite flowcytometric utilizzando il software CellQuest Pro (IVD) (entrambi di BDBiosciences).

Analisi di attivazione Caspase-3

Le cellule sono state seminate a una densità di5×103/pozzetto in piastre a 96 pozzetti. L’attività di Caspase-3 è stata misurata utilizzando un kit di analisi dell’attività di caspase-3 secondo le istruzioni del produttore (Promega). Cento microlitersreaction buffer con substrato 10 µl Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroanilina (pNA) è stato aggiunto in 10 µl proteincell lysate/well e incubato a 37°C per 6 h. Attività Caspasi-3è stato analizzato con un’assorbanza di 405 nm.

Trasfezione cellulare

miR-192-5p, anti-miR-192-5p e negative controlmimics (MIR-NC) sono stati tutti acquistati da Sangon Biotech. Le cellulesono stati seminati in piastre a 6 pozzetti e cresciuti al 50-60% confluenza priorto trasfezione. Le imitazioni sono state trasfettate con Lipofectamine2000 in cellule secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen Life Technologies). Gene o proteina è stato isolato 24 trasfezione hafter e utilizzato per la trascrizione inversa-quantitativepolymerase chain reaction (RT-qPCR) o Western blot analisi,rispettivamente.

RT-qPCR

Le celle sono state seminate a una densità di5×103/pozzetto in piastre a 96 pozzetti. L’RNA totale è stato estrattodalle cellule utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies).La concentrazione di RNA è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop®ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE, Stati Uniti d’America). La quantificazione dei miRNA è stata eseguita da un kit di analisi miRNA TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA). L’RNA totale è stato sottoposto alla sintesi di cDNA di primo filamento ed esaminato utilizzando un kit di reagenti RT PrimeScript (entrambi provenienti da Takara,Shiga, Giappone). qPCR è stato eseguito utilizzando SYBR-Green PCR Master Mix (Takara) sul sistema ABI 7500HT. I primer utilizzati nelle azioni sono mostrati nella tabella I.

Tabella I I primer PCR utilizzati nelle azioni.

Analisi Western blot

Le cellule sono state seminate a una densità di5×103 / pozzetto in piastre a 96 pozzetti. Le cellule coltivate sono state lavate due volte con PBS ghiacciato e incubate con tampone di lisi ghiacciato per 30 min su ghiaccio. Il liquido cellulare è stato raccolto e centrifugato at12, 000 × g per 10 min a 4°C. La concentrazione di proteine solubili è statadeterminata utilizzando un kit di analisi della proteina BCA (Sigma, St. Louis, MO,USA). Le proteine totali (10 µg) sono state eseguite su gel di dodecilsolfato di sodio (SDS)-poliacrilammide al 12% e trasferite su membrane di polivinilidendifluoruro (PVDF). Le membrane sono state bloccate con soluzione salina tamponata (TBS) contenente il 5% di latte non grasso per bloccare siti di legame non specifici. Le membrane sono state incubate con anti-PI3K (1:1.500) e anti-Akt (1:1000) (entrambi da Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) e anti-β-actina (1: 500;Sangon Biotech) durante la notte a 4°C. Dopo essere stati lavati con 1% Tween-20 / PBS, le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari (Tiangen, Pechino, Cina) per 2 h a temperatura ambiente.Le proteine sono state rilevate utilizzando una maggiore chemiluminescenza (Vilber, Marne La Vallée, Francia).

Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software SPSS 19.0. I risultati sono presentati come media ± SD. I risultati sono stati analizzati utilizzando il t-test dello studente o l’analisi unidirezionale della varianza(ANOVA). P<0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

La curcumina inibisce la vitalità delle cellule A549

Le concentrazioni (5, 10, 20 e 40 µM) e i periodi di tempo (12, 24 o 36 h) della curcumina rispetto alle cellule A549 sono stati valutati utilizzando il test MTT. Fico.2 mostra che il trattamento delle cellule A549 per 12, 24 o 48 ore con 10, 20 e 40 µM di curcumina ha inibito la vitalità cellulare in modo dipendente dal tempo e dal tempo. Il test MTT ha indicato cheil trattamento con curcumina (20 e 40 µM) per 24 o 36 h ha prodotto una vitalità cellulare insignificante, rispetto al gruppo di controllo(Fig. 2).

La curcumina induce apoptosi delle cellule A549

Prima del trattamento, è stata misurata anche la velocità apoptotica delle cellule A549 trattate con curcumina (10, 20 o 40 µM). Dopo il trattamento con 20 o 40 µM di curcumina per24 ore, il tasso apoptotico è notevolmente aumentato in un fattore dose-dipendente, rispetto al gruppo di controllo (Fig. 3).

La curcumina induce l’attività caspasi-3 delle cellule A549

Per determinare se la curcumina induce l’attività caspasi-3 delle cellule A549, l’attività caspasi-3 è stata misurata utilizzando il kit di analisi dell’attività acaspasi-3. Anche l’attività della caspasi-3 è aumentatasignificativamente in modo dose-dipendente dopo il trattamento con curcumina (20 o 40µM) per 24 ore, rispetto al gruppo di controllo(Fig. 4). Questi risultati indicavano che la curcumina induceva l’apoptosi nelle cellule A549.

miR-192-5p inibisce la vitalità cellulare e induce l’apoptosi delle cellule A549

Per esaminare l’espressione e il significato di MIR-192-5p nelle cellule tumorali epiteliali e polmonari normali del polmone umano,l’espressione relativa miR-192-5p è stata rilevata utilizzando RT-qPCR.Fico. 5A mostra che l’espressione MIR-192-5prelativa delle cellule NCL-H460 era relativamente inferiore, quella delle cellule a549 era più alta, con le cellule BEAS-2E che erano le più espresse.

Per analizzare se miR-192-5p influenzato cellviability e apoptosi delle cellule A549, abbiamo transfected MIR-192-5pmimics in cellule A549. Le cellule trasfettate con MIR-192-5pmimics hanno mostrato un significativo aumento di 120 volte nell’espressione miR-192-5 dopo la trasfezione di 48 h, rispetto al gruppo di controllo ormiR-NC (Fig. 5 TER).La sovraespressione di miR-192-5p ha ridotto la vitalità delle cellule A549, rispetto al gruppo di controllo o MIR-NC (Fig. 5 QUATER). Tuttavia, la sovraespressione di MIR-192-5p ha indotto il tasso apoptotico delle cellule A549, rispetto al controllo o al gruppo miR-NC (Fig.5D).

Inibizione di miR-192-5p sopprime cellviability e induce apoptosi di cellule A549

Per determinare se anti-miR-192-5p influenzato thecell vitalità e apoptosi di cellule A549, abbiamo transfectedanti-mir-192-5p imita in cellule A549. Il livello di espressione dimiR-192-5p è stato rilevato utilizzando RT-qPCR dopo 48 ore di trasfezione.Anti-Mir-192-5p imita efficacemente l’espressione MIR-192-5prelative delle cellule A549 (Fig.6 BIS). La downregulation di MIR-192-5p ha promosso la vitalità delle cellule e ha inibito il tasso apoptotico delle cellule A549, rispettivamente, rispetto al gruppo di controllo o miR-NC (Fig.6 TER e C).

Curcumina inibisce MIR-192-5p geneexpression delle cellule A549

Per determinare se la curcumina influenzato espressione MIR-192-5pgene delle cellule A549, il livello di espressione di miR-192-5pwas rilevato utilizzando RT-qPCR dopo il trattamento con curcumina per 24h. Fig. 7 mostra che il livello di espressione di miR-192-5p è stato notevolmente migliorato dalla curcumina (20 o 40µM).

miR-192-5p inibisce l’effetto ofcurcumin sulla vitalità cellulare e induce l’apoptosi delle cellule A549

Per esaminare come l’over-espressione di miR-192-5pinfluenced l’effetto della curcumina sulla vitalità cellulare e theapoptotic tasso di cellule A549, abbiamo transfected miR-192-5p imita intoA549 cellule. Fico. 8 mostra che la curcumina sopprimeva la vitalità cellulare e aumentava il tasso apoptotico delle cellule A549 dopo il trattamento con curcumina (20 µM) per24 ore, rispettivamente, rispetto al gruppo di controllo. L’effetto dicurcumina (20 µM) sulla vitalità cellulare e il tasso apoptotico diA549 cellule sono stati marcatamente diminuiti e aumentati di MIR-192-5pmimics, rispettivamente, rispetto al gruppo trattato con curcumina(Fig. 8 BIS).

Inibizione di miR-192-5p sopprime theeffect della curcumina sulla vitalità cellulare e induce l’apoptosi delle A549cells

Per esaminare come la downregulation di espressione di miR-192-5pinfluenced l’effetto della curcumina sulla vitalità cellulare e theapoptotic tasso di cellule A549, abbiamo transfected anti-miR-192-5p mimicsinto cellule A549. Fico. 9 mostra che la curcumina sopprimeva la vitalità cellulare e aumentava il tasso apoptotico delle cellule A549 dopo il trattamento con curcumina (20 µM) per24 ore, rispettivamente, rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, l’effetto della curcumina (20 µM) sulla vitalità cellulare e il tasso apoptotico delle cellule A549 sono stati marcatamente aumentati e ridotti da imitazioni anti-miR-192-5p, rispettivamente, rispetto al gruppo trattato con la curcumina (Fig.9 BIS).

La curcumina inibisce l’espressione della proteina PI3K/Akt delle cellule A549

Per determinare se la curcumina ha influenzato l’espressione della proteina PI3K/Aktproteina delle cellule A549, l’espressione della proteina PI3K/Akt è stata rilevata utilizzando l’analisi western blot dopo il trattamento con la curcumina per 24 ore. Fig. 10 mostra che l’espressione della proteina PI3K/Akt è stata notevolmente migliorata dalla curcumina (20 o 40 µM).

miR-192-5p si rivolge direttamente alle cellule PI3K/Akt ofA549

Per esaminare come la sovraespressione di MIR-192-5pinfluenzato l’espressione della proteina PI3K/Akt delle cellule A549, wetransfected MIR-192-5p imita in cellule A549. Fico. 11A e B mostrano che la curcumina ha soppresso le espressioni proteiche PI3K / Akt delle cellule A549 in seguito al trattamento con curcumina (20 µM) per 24 ore, rispetto al gruppo di controllo. L’effetto della curcumina (20 µM) sull’espressione proteica PI3K/Akt delle cellule A549 è stato evidentemente ridotto dai mimici MIR-192-5p, rispetto al gruppo trattato con curcumina(Fig. 11C e D).

L’inibizione di MIR-192-5p aumenta l’espressione di thePI3K/Akt delle cellule A549

Per determinare se l’anti-miR-192-5p ha influenzato l’effetto della curcumina sull’espressione della proteina PI3K/Akt delle cellule A549, imita l’anti-MIR-192-5p nelle cellule A549. Fico. 12A e B mostrano che la curcuminasoppresso l’espressione proteica PI3K/Akt delle cellule A549 seguentetrattamento con curcumina (20 µM) per 24 h, rispettivamente,rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, l’effetto della curcumina(20 µM) sull’espressione proteica PI3K/Akt delle cellule A549 è stato notevolmente migliorato dalle imitazioni anti-miR-192-5p, rispettivamente, rispetto al gruppo trattato con curcumina (Fig.12C e D).

Discussione

Un milione di pazienti soccombono a NSCLC ogni anno in tutto il mondo e l’incidenza di NSCLC è gradualmente in aumento.Sebbene un certo numero di studi negli ultimi anni si siano concentrati sul NSCLC,non sono stati fatti grandi progressi per quanto riguarda il trattamento. La chirurgiarimane il metodo di trattamento più efficace, ma in termini diprevenzione così come per la patogenesi di NSCLC ulteriori studi devono essere condotti (14,15). Recentemente, Liu et al hanno identificato che la curcumina inibisce la proliferazione e induce significativamente il tasso apoptotico cellulare delle cellule tumorali gastriche (16). Ma et al hanno dimostrato chela curcumina inibisce la crescita cellulare e l’invasione delle cellule del cancro pancreatico (17). Collettivamente, le nostre scoperte hanno indicato che la curcumina sopprimeva la vitalità cellulare, induceva l’apoptosi cellulare e aumentava l’attività caspasi-3 delle cellule A549.Pertanto, la curcumina è un potenziale farmaco per l’oncoterapia.

Il miRNA è una classe di RNA a piccola molecola che ha un ruolo molto importante nella regolazione dell’espressione genica come recentemente identificato (18). I geni miRNA sonodi solito si trovano nei segmenti introni del gene. Tuttavia, i MIRNA sono distribuiti anche al di fuori degli esoni non codificanti del gene e della regione intergenica, che sono stati trovati per partecipare a una serie di noti percorsi oncogenici, come p53, Bcl-2 e K-Ras(19). È stato dimostrato che> 50% dei MIRNA umani definiti si trovano nei siti fragili del genoma e questi siti fragili sono spesso associati all’insorgenza di NSCLC (20). I profili di espressione di MIRNA sono associati allo sviluppo di NSCLC. miR-34c, miR-145 e miR-142 possono inibire NSCLC (5). I risultati del presente studio indicano che l’espressione relativa miR-192-5p delle cellule NCL-H460 era relativamente bassa, quella delle cellule A549 era più alta, con le cellule BEAS-2E che erano le più espresse. La sovraespressione di miR-192-5pdecreased la vitalità delle cellule ed ha aumentato il tasso apoptotico ofA549 celle. Downregulation di miR-192-5p ha aumentato il cellviability e ha ridotto il tasso apoptotico delle celle A549.Inoltre, la curcumina ha inibito l’espressione genica miR-192-5p di A549cells. Tuttavia, l’upregulation di MIR-192-5p espressione enhancedthe effetto della curcumina sulla vitalità cellulare e il tasso apoptotico ofA549 cellule, mentre il downregulation di MIR-192-5p expressionreversed l’effetto della curcumina su A549 cellule. I nostri risultati erano coerenti con quelli di altri studi. Ad esempio, Ye etal ha riferito che la curcumina promuove l’apoptosi cellulare attivando Mir-192-5p (21). Tuttavia, i meccanismi di theprobable su come la curcumina influenza MIR-192-5pexpression non sono chiari e gli studi futuri per determinare questo effectshould sono effettuati.

Negli ultimi anni, l’effetto del percorso PI3K/Aktsignaling sul NSCLC umano ha guadagnato molta attenzione(22). L’attivazione della via PI3K/Aktsignaling è molto comune nel NSCLC umano, che può promuovere l’insorgenza del cancro attraverso una varietà di meccanismi, tra cui mutazioni genetiche, riduzione dell’espressione del gene soppressore del cancro, mutazione o amplificazione PI3K, mutazione Akt o amplificazione e attivazione del recettore oncogene (7). L’attivazione di ogni componente di questo percorso è la ragione principale della prognosi sfavorevole di NSCLC, che può portare alla resistenza ai farmaci del trattamento, quindi l’inibizione di questa via può invertire la resistenza ai farmaci e migliorare gli effetti della chemioterapia e delle radiazioni in vivo (23). I dati ottenuti nel presentestudio ha rivelato che la curcumina sopprimeva la proteina PI3K/aktespressione delle cellule A549. Upregulation di MIR-192-5p expressionrefrained l’espressione della proteina PI3K/Akt delle cellule A549.Downregulation dell’espressione miR-192-5p può aumentare l’espressione PI3K/Aktprotein delle cellule A549. Xu et al hanno dimostrato che la curcumina inibisce l’invasione e la migrazione della cellula FTC133VIA downregulation della via di segnalazione PI3K/Akt nelle cellule tiroidee (24). Xu et ha anche suggerito che la curcumina inibisce la proliferazione tumorale del cancro ai polmoniattraverso la via PI3K/Akt (25).Schee et al hanno rivelato che miR-22-3p, miR-143-3p e MIR-192-5p hanno regolato e sono stati coinvolti in APC, TGFß e PI3Kpathway nelle cellule tumorali del colon-retto (26).

In conclusione, questo studio si è concentrato sull’effetto della curcumina contro le cellule A549, sulla proliferazione cellulare inibita e sull’apoptosi indotta del NSCLC umano attraverso l’upregulation ofmiR-192-5p e la soppressione della via di segnalazione PI3K/Akt. Le conclusioni del presente studio indicano che la curcumina è un obiettivo potenziale nel trattamento di NSCLC. Tuttavia, lo studio attuale ha rivelato alcune limitazioni in quanto non abbiamo esaminato la relazione dettagliata tra miR-192-5p e la via PI3K/Akt nelle cellule lungcancer. Ulteriori studi in vivo, analisi statistiche cliniche e su scala più ampia del presente studio devono essere eseguiti per verificarne i risultati.