キナーゼ活性タグ付きウェスタンブロッティングアッセイ

蓄積の証拠は、リン酸化/脱リン酸化シグナル伝達の混乱が細胞の病理学的行動に関連していることを示唆している。 ホスホプロテオームプロジェクトは、細胞タンパク質中のほぼ300,000リン酸化されたSer/Thr/Tyr残基を同定している。 並行して、ヒトゲノムプロジェクトは約500のプロテインキナーゼを発見した。 しかし、限られた数のプロテインキナーゼが各リン酸化部位に割り当てられている。

ゲル内リン酸化アッセイは、SDSで可溶化されたサンプル中のプロテインキナーゼ活性を検出するための便利な方法でした。 この方法は、CaMKII、MYPT1-K（またはZIPK）などの同定に適用されました。 このアッセイプロトコルでは、プロテインキナーゼは、基質ポリペプチドを埋め込まれたSDS-ポリアクリルアミドゲル上にロードされ、その後、リン酸化基質を検出するためにオートラジオグラフィーに続いて、放射性ATPを用いた再飽和、リン酸化に供されます。 さらに，放射性ＡＴＰを用いてニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上でキナーゼの自己りん酸化を検出した。 放射性物質は安全規則のためにユーザーのための限定、であるかもしれません。 さらに，りん酸化蛋白質のオートラジオグラムはりん酸化部位の情報を欠いている。

ここでは、従来のゲル内リン酸化アッセイに非放射性代替アッセイを最適化しました。 キナーゼ活性タグ付きウェスタンブロッティング（KAT-WB）という名前は、これが正常に自分自身を自己リン酸Tyrキナーゼだけでなく、ホスホ（P）特異的抗体を使

図1は、Tyr-キナーゼ自己リン酸化アッセイのKAT-WBデータを示しています。 重複ブロットを作るために、抽出物の二つのアリコートは、sdsポリアクリルアミドゲル上にロードされ、電気泳動に供し、その後、タンパク質は、PVDF膜（0.2μ m）のシート 膜を、緩衝化された2-プロパノール、6.0M塩酸グアニジン（Gu-HCl）、3.0M Gu-HCl、0.1M Gu-HClおよび再飽和緩衝液（補足プロトコルを参照）で順次処理した。 ４℃での一晩の再飽和工程の後、膜を縦に切断して、２つの重複片を生成した（図１）。 一枚の膜を１ｍ Ｍ Ｍｇａｔｐで６ ０分間インキュベートした。 他の膜片を対照としてＭｇａｔｐなしでインキュベートした。 両方のシートを、抗Ｐ−Ｔｙｒ抗体（１：５ ０ ０ ０希釈でクローンＰＹ２ ０）で同時に免疫検出に供した。 図1に示すように、複数のP-Tyrバンドは、対照膜（左上）の100、70、45および35kDaで検出された。 これらのＰ-Ｔｙｒ蛋白質は抽出前に既にリン酸化されていたと考えられた。 分離後のMgATPとのインキュベーションは、心筋ライセート（図1、右上、レーン2）で45kDaでタンパク質のTyrリン酸化を上昇させ、再生後の膜上のこのキナーゼにおけるTyr残基の自己リン酸化を示している。 図1は、レーン2(-/+MgATP)のデンシトグラムを示しています。 二つのブロット上のタンパク質の同等の負荷を確認するために、フィルタはクーマシー染色に供された（図1、下）。 技術的なノートは、方法を開発する過程で、我々は緩衝2-プロパノールと6M Gu-HClによる治療は、キナーゼ活性の検出のために両方必要であったことがわかった、 したがって、KAT-WBは45-kDa Tyrキナーゼを検出した。

KAT-WBの別のバージョンは、キナーゼに近接してPVDF膜に吸収された基質タンパク質の部位特異的リン酸化を使用する。 我々は、ホスファターゼホロ酵素阻害剤-1（PHI-1）thr57でのリン酸化は、タイプ1Ser/Thrホスファターゼの阻害剤にこの細胞タンパク質を変換する関心のあるタン 図2Aは、陽性対照組換えZIPKとして、Thr57で組換えPHI-1をリン酸化することが知られているSer/Thrキナーゼを用いたKAT-WBデータを示す。 変性および段階的な再飽和プロセスの後、膜を、組換えPHI-1野生型（WT）または非リン酸化可能バージョン（T57H）を補充した再飽和緩衝液に4℃で一晩浸漬し、0.2mg/mlでリン酸化反応を実行した。 膜上のリン酸化PHI-1は、抗P-PHI-1（Thr57）抗体を用いて検出され、これは組換えZIPKのバンドを明らかにした。 しかし、わずかな信号のみがPHI-1なしまたはPHI-1のT57Hバージョンでコントロール膜上で検出されました。 これらのデータは，膜上のレナチュレートキナーゼが膜上に吸収される基質をリン酸化することができることを示唆している。 組織および細胞中の複数のPHI-1キナーゼを検出するためにKAT-WBを適用した（図2B）。 ラット骨格、心筋およびNeuro2A細胞からの抽出物は、KAT-WBアッセイに供した。 NO-ATPコントロール（左、上）と比較して、P-PHI-1のシグナルは、1mM MgATP（右、上）とインキュベートブロットに登場しました。 P-PHI-1の著名なバンドは、100、60および49kDa（レーン3、オープン矢頭）で神経2A細胞溶解物で検出されました。 しかし、p-PHI-1のバンドは、骨格および心筋（レーン1および2）の抽出物とレーンで明らかではなかった。 Ｐ−ＰＨＩ−１シグナルは、ＰＨＩ−１なしではリン酸化ステップによって増強されなかった（図２、下、ブランク：ＢＬＫ）。 これらの結果は、神経細胞ではなく、骨格や心筋で発現する複数のPHI-1キナーゼがあることを示しています。 これにより、細胞や組織内の複数の基質特異的キナーゼを検出するための強力なツールが提供されます。 技術的な注意点は、ＰＨＩ−１による一晩の再飽和がリン酸化シグナルの検出に必要であり、より高い濃度のＰＨＩ−１は染色強度を増加させなかった（図示せず）こ

これらのデータに基づいて、我々はKAT-WBは、組織や細胞に存在する複数のプロテインキナーゼによってtyrキナーゼの自己リン酸化と目的の選択的基質蛋白質の部位特異的リン酸化を検出することができることを提案している。 KAT-WBは本質的に分子サイズを露出する粗野な混合物のキナーゼ活動を、細胞のエキスのような検出する従来のゲルのリン酸化の試金の利点を共有する。 これら二つのアッセイのもう一つの利点は、これらのアッセイのためのサンプルは、抽出物中のリン酸化および脱リン酸化を排除し、SDSを含む緩衝液で迅速に変性されるため、細胞内のキナーゼの翻訳後修飾（PTMs）は、特定の条件下で所望の時点で保存することができることである。 ほとんどのプロテインキナーゼはPTMを介して調節されている。 KAT-WBは、規制PTMsがまだ特徴付けられていない場合でも、キナーゼ活性の変動を監視することができます。 KAT-WBは、使用される条件下で効果的に再生する単量体酵素のみが活性を示すため、細胞抽出物中のすべてのキナーゼを検出することができない。 しかし、KAT-WBの修飾は、ゲル内リン酸化アッセイによって行われているように、カルモジュリンとサイクリンによって調節されるキナーゼを検出することができるはずである。 再生効率の改善とキナーゼに対する抗体との免疫沈降/免疫デプレッションとの組み合わせは、このアプローチの有用性を拡大する可能性がある。

PTM特異的抗体が利用可能な場合、リン酸化に加えて、kat-WBプロトコルの原理をアセチラーゼ、メチラーゼ、ユビキチンリガーゼなどの他のPTM酵素の検出に適用 部位特異的PTMsを認識する抗体の開発に伴い、活性タグ付きウェスタンブロッティングによってカバーされる研究標的を拡大する。