ウイルスを用いた実験研究において、ウイルス力価を制御することが重要である。 異なった実験室で行われる調査間の比較を促進するためには調和させた標準的な方法の使用は望ましいです。 ヒトヘルペスウイルス6（HHV-6）、ほとんどの人がにさらされているβ-ヘルペスウイルスのために、50％組織培養感染性用量（TCID50）法は、ウイルス力価の評価のた 一般的に使用される読み出しは、細胞変性効果（CPE）、すなわち感染細胞の拡大のための眼の検査である。 このアプローチの障害の1つは、感染していなくても細胞が拡大する可能性があることです。 滴定シリーズの感染の境界線では、感染により拡大した細胞はウイルスの希釈が増加すると拡大しにくい傾向があるため、特に困難である（追加ファイル1：図S1）。 Immunofluorescenceの試金(IFA)はTCID50査定の目の点検へまたは伝染性の単位、すなわち感染させた細胞の一部分の計算のための代わりとなる読み出しのアプローチである。 IFAベースの読み出しは、感染した細胞と感染していない細胞との識別においてより明確であるが、染色は面倒であり、信頼性の高い値を得るためには 個々の細胞のモニタリングは、細胞の陽性、眼の検査とIFAベースの読み出しの両方の欠点を誤解するリスクを意味します。 したがって、我々は開発し、ウイルスDNA負荷の増加は、リアルタイム定量PCR（Q-PCR）を使用してTCID50培養プレートのすべての滴定ウェルで測定されるTCID50の代替 このアプローチは、眼検査とTCID50のIFA読み出しと、上記の感染ユニットアプローチと比較した。＜５ ９ ７ ７＞＜７ ７ ６ ８＞Ｈ Ｈ Ｖ−６Ａ（ＧＳ株）を、１ ０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｕ Ｔ）、１ ０ ０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１ ０ ０μ ｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲｐｍｉ１ ６ ４ ０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を含むＧｌｕｔａｍａｘ中のＴ細胞株Ｈ ＳＢ−２ 生細胞の約５ ０％が拡大したときに、上清を回収し、分析まで−８ ０℃でアリコート中で直ちに凍結させた。 対照として、継代１ ７（Ｐ１ ７）のウイルス上清を、ＵＶ光により２ ０分間、または５ ６℃で１時間熱処理して不活性化した。 ＨＳＢ−２細胞におけるＨ Ｈ Ｖ−６Ａ複製を、前述のようにＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して１ ０日間追跡した。 Ｑ−ＰＣＲ分析の前に、製造業者のプロトコール（Ｍａｇｍａｘ−９ ６Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って９ ６ウェルプレートビーズベースのキットを使用して、細胞懸濁液からＤＮＡを抽出した。 ウイルスバッチ中のＨ Ｈ Ｖ−６Ａ ＤＮＡ含量を評価するために、フィルターカラム（ＱＩＡＧＥＮ Ｇｍｂｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したＤＮＡ抽出後に上記のようにＱ−ＰＣＲを行った。＜5977＞＜7768＞TCID50培養プレートをセットアップするために、丸底96ウェル培養プレートにウェルあたり40μ lの104HSB-2細胞の細胞懸濁液を播種した。 細胞に、１ ６ ０μ ｌの５倍希釈のＨ Ｈ Ｖ−６Ａ上清を３〜４時間接種し、１希釈当たり６回の複製を行った。 模擬および培地対照は、すべてのプレート上の三重ウェルに含まれていた。 細胞を１回洗浄した後、５ ０〜７ ０μ ｌの細胞懸濁液を全てのウェルからサンプリングし、感染後ゼロ日（ｄｐｉ）試料として−８ ０℃で保存した。 残りの細胞懸濁液を３ ７℃で７日間インキュベートした。 ７ｄｐｉで、解凍したｚｅｒｏ ＤＰＩプレートおよび７ｄｐｉプレートを、上述したビーズベースのキットを用いてＤＮＡ抽出した。 その後、ウイルスＤＮＡを上記のようにＱ−ＰＣＲにより定量した。＜５ ９ ７ ７＞＜７ ７ ６ ８＞ＩＦＡについて、細胞を、アセトンとメタノールの１：１混合物でガラススライド上に−２ ０℃で１ ０分間固定し、ＰＢＳ中の５％ヤギ血清および３％ＢＳ Ａで遮断し、ｈ Ｈ Ｖ−６糖タンパク質ｇｐ１ １ ６／５ ４／６ ４（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍ Ｄ）に特異的な一次マウスモノクローナル抗体で染色した。 この染色を、Ａｌｅｘａ６ ３ ３結合ヤギ抗マウスＩｇｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって可視化した。 細胞核を可視化するために、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃ Ａ）による染色を使用した。 カバースリップを装着媒体（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で装着し、スライドを共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析した。 感染細胞の画分を手動計数によって決定した。 細胞の≥1/3がウイルスタンパク質を含んでいた場合、ウェルあたり≥25細胞がカウントされ、細胞の<1/3がウイルスタンパク質を含んでいた場合、ウェルあたり≥100細胞がカウントされた。 陽性染色された細胞の≥2％が感染したと考えられた井戸。 各ウェルにおけるウイルスＤＮＡ負荷増加のレベルは、ソフトウェアＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｗ Ａ）の式を構築するＩＦＡ染色と相関した。 この式は、TCID50プレート内の特定のウェル内のウイルスDNAが設定されている特定の回数をシフトしているかどうか、および非常に同じウェルがIFAで正
Q-PCR読み出しとの比較のために、すべてのTCID50プレートは、二つの独立した検査官（眼TCID50）による位相コントラスト顕微鏡を用いた眼検査によって評価された。 少なくとも一つの拡大細胞が見つかった場合、ウェルは感染したと考えられた。 両方の読み出しアプローチについて、TCID50はReedとMuenchの式に従って計算されました。
Q-PCR（Q-PCR TCID50）によって決定されたTCID50の結果を、IFA（Louis Flamandとの個人的なコミュニケーション）による感染ユニット評価と比較した。P19については三つの時点、P27については一つの時点で比較した。 手短に言えば、2.5*105のHSB-2細胞を、上記のように、希釈ごとに3倍のウェル中でウイルスの様々な希釈液を接種した。 ２つのｄｐｉで、細胞を初期ウイルスタンパク質ｐ４ １を標的とするＩＦＡに供した（clone9A5D12,Santa Cruz Biotech. (株)、CA）上記のように。 Ml当たりの感染単位として表されるウイルス力価は、感染細胞の画分にゼロdpiでの細胞の総数および希釈因子を乗算することによって計算された。
ウイルスDNA負荷増加測定のための最適な時点を決定するために、ウイルス複製を十日間追跡した。 ウイルスDNAの十分な増加に達するまでに7日間が必要であった（図1）ので、収穫時期として選択された。 陽性感染に対応する相対的なウイルスＤＮＡ増加のカットポイントを設定するために，ウイルスＤＮＡ負荷増加はウイルス蛋白質発現と相関した。 IFAは、二つの異なるウイルスバッチのための三つのTCID50プレート内のすべてのウェルからの細胞上の七dpiで行われました。 最適なカットポイントは、タンパク質発現との相関がウェルの93％で見られたウイルスDNAの十時間の増加であることが判明しました（図2）。
ＨＨＶ-６Ａ（Ｇ ｓ株）の複製に続いてＱ-ＰＣＲを行う。 示されるデータは、感染の多重度（ＭＯＩ）ごとの３回培養物の平均結果（±ＳＥＭ）である。 ウイルスDNAの負荷が検出限界の下で落ちたとき接続ラインは中断する。
感染のためのカットポイントの決定。 感染のための最適なカットポイントは、タンパク質発現への相関が後期ウイルスタンパク質gp116/54/64を標的とする抗体とIFAによってウェルの93％で見 ウイルスDNA負荷が十倍に増加していなかったウイルスタンパク質は含まれていなかった。 示されたデータは、３つのＴＣＩＤ５ ０プレートからの平均結果（±ＳＥＭ）である。
q-PCR TCID50の値を眼およびIFA TCID50と比較すると、一つのQ-PCR TCID50は、それぞれ13または5の評価に基づいて1.41眼および1.03IFA TCID50に等しくなりました。 Q-PCR TCID50は、眼またはIFA TCID50と比較して統計的に異なる値を与えなかった（それぞれp=0.41またはp=0.29）（対のtテスト）（表1）。
ウイルスDNAのコピー数は頻繁に特定のウイルスのバッチが含んでいるウイルスの粒子の量の概算として使用されます。 しかし、これが感染力にどれだけ対応しているかは不明である。 これを評価するために、ＴＣＩＤ５ ０値を、それぞれのバッチのウイルスＤＮＡコピー数と比較した。 ウイルスバッチ中のQ-PCR TCID50値に対するウイルスDNA負荷の平均比は、P17およびP19について同様であり、TCID50あたりそれぞれ6.3*105および2.0*106ウイル しかし、P21については、比はかなり高く、TCID50あたり1.3*108ウイルスDNAコピーであった（表1）。 したがって、バッチの上清中のウイルスDNAを測定することは、バッチの感染性を正しく割り当てるには不十分であり、したがって、ウイルス力価を正確
Q-PCR TCID50の変動の平均イントラアッセイ係数（CV）は9％であり、三つのTCID50培養プレートの並列重複抽出およびq-Pcrによって決定された。 眼のTCID50については、イントラアッセイCVは45％であり、二つの独立した評価者によって読み取られた十二TCID50培養プレートの合計によって決定された。 イントラアッセイCVは、二つのランからの細胞の二つの平行染色によって決定されたIFA TCID50のための14％であった。 感染ユニットのアプローチのために、イントラアッセイCVは、一回の実行からの細胞の四つの平行染色によって決定された43％であった。 平均インターアッセイCVは、Q-PCR TCID50のための73％と眼TCID50のための66％であり、それぞれ五、三、三回実行される三つのウイルスバッチについて決定した。 ＩＦＡ ＴＣＩＤ５ ０について、インターアッセイＣＶは２ ５％であり、１回のバッチ実行で３回測定した。 感染ユニットアプローチのために、インターアッセイCVは、一つのバッチのための三つの別々の実行によって決定された77％であった。
要約すると、ここで説明するQ-PCR TCID50法は、ウイルスタンパク質の発現とよく相関し、したがって、感染用量に対して高い特異性を有する。 これは、イントラアッセイCV値に基づいて、眼TCID50、IFA TCID50および感染ユニットアプローチよりも堅牢です。 イントラアッセイＣＶは、この設定では、特定の読み出しアプローチがいかに正確であるかの尺度であり、従って、異なる方法の比較のための最も正確な値である。 この方法を適応させるためには、試験されたすべてのウイルス株および使用されたすべての細胞株について切断点を決定する必要がある。 Q-PCR読み出しアプローチは、眼検査よりも面倒ですが、私たちの意見では、IFA TCID50と感染ユニットアプローチよりもかなり少ない面倒です。 それは目の点検、IFA TCID50および伝染性の単位のアプローチより実験室資源の点では高いです。 しかし、我々のデータは、コストと労力を保証するかもしれない正確にウイルス力価を決定するために生物学的アッセイを実行することの重要性を強調 さらに、HHV-6フィールド内で使用されるウイルス力価評価方法のより良い標準化は、異なる研究間の一致を高める可能性があります。