プロテインキナーゼは、細胞シグナル伝達に関与する最大の酵素スーパーファミリーであり、さまざまな疾患の治療標的を表しています。 触媒作用のメカニズムを理解し、抑制剤を発見し、細胞機能を識別する多くの実験室からの集中的な努力がずっとあります。 このレビューでは、プロテインキナーゼを分析するために開発された二つのアプロー: bisubstrateのアナログの阻止およびphosphonateのアナログの利用。 これらの方法は，キナーゼ-基質相互作用の理解とりん酸化の機能解明を進めるために，蛋白質半合成法発現蛋白質ライゲーションと組み合わせて使用されている。 プロテインキナーゼ機構の性質に関する以前の研究は、それが解離遷移状態に従うことを示唆している。 解離遷移状態反応座標距離の幾何学を模倣するためにインスリン受容体キナーゼに対してbisubstrateアナログを設計した。 このｂｉｓｕｂｓｔｒａｔｅ化合物はインシュリン受容体キナーゼに対する強力な阻害剤であり，ペプチド結合部位とヌクレオチド結合部位の両方を占めていた。 アデニンとペプチドの間のスペーサを変化させるだけでなく、水素結合電位を変化させたビス基質化合物は、元の設計上の特徴の重要性を示している。 我々はまた、関連bisubstrate類似体が強力にプロテインキナーゼAを含むセリン/スレオニンキナーゼをブロックするために使用できることを示しています。 多くのプロテインキナーゼは効率的なリン酸化のために折り畳まれたタンパク質基質を認識するので、ペプチド-ATP複合体をタンパク質構造に組 発現蛋白質ライゲーションを用いて，Ｓｒｃ-ＡＴＰコンジュゲートを生成し，Ｃｓｋチロシンキナーゼに対する高親和性リガンドであることを示した。 PhosphoSer/phosphoTyrの非加水分解性模倣物は、リン酸化事象の機能性を調べるのに有用であり得る。 発現蛋白質ライゲーションを用いて，ホスホノメチレンフェニルアラニンとホスホノメチレンアラニンを用いて，それぞれＴｙｒとＳｅｒのりん酸化をプローブした。 これらのツールは、対応するリン酸化イベントによって媒介される触媒活性の新規分子内刺激を明らかにする、SH2-ホスファターゼ（SHP1とSHP2）の分析を それらはまた、リン酸化によってメラトニン律動酵素の細胞調節を特徴付けるために使用されている。