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緑膿菌は、土壌や水に見られる遍在する環境グラム陰性細菌です。 それはまた、嚢胞性線維症（CF）患者を含む自然免疫欠損を有する個体に感染を引き起こす日和見病原体でもある（8）。 P.aeruginosaは土および水の低酸素の環境に出会う。 証拠は、CFを有するヒトでは、細菌は、少なくとも部分的には、気道内の粘液膿性塊またはバイオフィルム内の低酸素環境にあり得ることを示す（19）。 P. 緑膿菌は、硝酸塩（ＮＯ３−）、亜硝酸塩（ＮＯ２−）、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）などの末端電子受容体の存在下、またはｌ−アルギニンが成長の基質である場合に嫌気的に成長 CF気道粘液は、緑膿菌（p.aeruginosa）の嫌気性成長をサポートするために、NO3−およびNO2−が十分に豊富である（7、19）。 本研究では，酸素の存在下および非存在下での成長中の緑膿菌プロテオームの比較を行った。

Ｓｔｅｖｅ Ｌｏｒｙ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ Ａ）から得られた緑膿菌株ＰＡＯ１を、１％ＫＮＯ３を添加したＬｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中の１ ２ ５ｍｌフラスコ中で、好気性増殖のために３ ７℃で２ ０ ０ｒｐｍで振とうして増殖させた。 嫌気性増殖は、前述のように（９）、ゴム栓付き１ ０ ０ｍｌ Ｗｈｅａｔｏｎ血清ボトル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の８ ０ｍｌの培地中で完了した。 媒体はN2のガスとの泡立つことに1時間服従することによって酸素の奪われました。 好気性および嫌気性条件の両方について、細菌は、嫌気性培養物の細胞密度（600nmでの光学密度）が好気性培養物の密度の44％であった点で、成長の後期対数相 収穫された培養物のpHsの間に有意差はなかった（嫌気性培養のためのpH7.6と好気性培養のためのpH7.4）。 同量の変性および減少した全細胞タンパク質(2.１ ２Ｃ）または重（１ ３Ｃ）開裂可能同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ Ａ）で標識し、処理し、前述のように分析した（３）。 報告されたデータは、少なくとも2つの独立した実験の平均値です。

六百十緑膿菌タンパク質をICATを用いて同定し、定量した（タンパク質の完全なリストについては、補足材料の表S1を参照）。 嫌気性成長中に存在量が変化した151のタンパク質のうち、76は存在量が高かった（表（表1）1）、75は存在量が低かった（表（表2）。2). 予想されるように、嫌気性増殖および脱窒に関与する１ ３個のタンパク質（ｎｉｒ、ｎｏｓ、およびｎａｒ遺伝子の産物を含む）は、嫌気性増殖中により高いレベルで発現1). これらの結果は，観察された蛋白質含量の変化には，異なる酸素レベルでの成長に特異的に生じる変化が含まれることを示唆している。

検出されたプロテオームの変化は、収穫された嫌気性培養の相対的な細胞密度が低いことを考えると、酸素張力の影響に加えて、すべての密度依存的 実際、嫌気的に増殖させた細胞でより低い存在量で検出された29個のタンパク質は、以前にクォーラムセンシングが誘導されることが示された遺伝子によ これらはシアン化水素のシンターゼのサブユニットHcnBおよびHcnCを含んでいます; Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓキノロンシグナル生合成酵素Ｐｑｓｂ、Ｐｑｓｃ、およびＰｑｓｄ；およびＰｈｎｂ（表（表２）。2). 本発明者らの結果と一致して、hcnおよびpqs遺伝子は、同じ細胞密度で収穫された好気性および嫌気性培養物を用いた最近のDNAマイクロアレイ分析によ

分泌されたPを識別する。 嫌気性増殖中に変化したレベルを有する緑膿菌タンパク質は、培養上清タンパク質を濃縮し（11）、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分離した（Fig. （図1）。1).1). 特異的に発現されたタンパク質に対応する四つのクーマシー染色タンパク質バンドを同定し、以前の研究（4）のように分析した（図。 （図1）。1).1). CbpDキチン結合タンパク質、LasBエラスターゼ、およびPA0572によってコードされる未知の機能のタンパク質：三つの分泌タンパク質の存在量は、嫌気性成長中に減少 以前のプロテオミクス研究では、これらのタンパク質の3つすべてがクォーラムセンシング誘導されていることがわかった(11)。 一つの蛋白質は嫌気性成長中に豊富に増加するように見え，鞭毛フィラメント蛋白質Ｆｌｉｃまたは鞭毛キャッピング蛋白質Ｆｌｉｄのいずれかとして同定された（これら二つの蛋白質の特性が重複するため）。

ほとんどの緑膿菌外膜タンパク質はシステイン残基を含まないため、ICATによって分析することはできません(4)。 したがって、補完的な方法として二次元（2D）ページを使用した（4）。 いくつかの外膜タンパク質（Fig. （図1）。2)2)を2Dゲルから切除し、同定した(4)。 ＯＰＲＥは嫌気性増殖中に存在量が増加するように見えたが、ＯｐｒｆおよびＯｐｒｈは存在量が減少するように見えた（図１ ０Ａ）。 （図1）。2).2). 3つのタンパク質はすべて、等電点集束中に複数の種として移動しました(図1)。 （図1）。2).2). 嫌気性増殖中のＯｐｒｆの存在量の減少は、ポリクローナル抗Ｏｐｒｆ抗血清（Ｒｏｂｅｒｔ Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ ａ ｔ Ｖａｎｃｏｖｅｒ，Ｃａｎａｄａからの贈り物）を使用して、外膜タンパク質の免疫ブロッティング（データ

嫌気性増殖中に増加した存在量を示した緑膿菌タンパク質のうち（表（表１；１；図１）、図２；図３；図４）。 図1.1.1.1）、1）、いくつかは、バイオフィルムの形成と開発に関与する機能に貢献しています。 これらのタンパク質には、異化物抑制制御タンパク質Ｃｒ Ｃおよび痙攣運動性タンパク質Ｐｉｌｕ、Ｐｉｌｇ、およびＣｈｐａが含まれる（１ ２、１ ３、１ ８）。 嫌気的に増殖させた細胞におけるＣｒｃレベルの増加と一致して（表（表１）、１）、Ｈｍｇａおよびｂｋｄ遺伝子産物を含む、Ｃｒｃ抑制の既知の標的の存在量が減少した（表（表２）、２）（６、１ ０）。 ChpAおよびPilGは、痙攣運動を制御する複雑な規制システムの構成要素である（18）。 まとめると、これらの結果は、バイオフィルム形成に影響を与える細胞表面付属物の発現または機能が嫌気性増殖中に変化することを示唆している。 このような変化は、嫌気的に成長している緑膿菌（20）のために観察された増加したバイオフィルム形成に貢献する可能性があります。

嫌気性増殖中に観察された外膜タンパク質の変化に加えて、ICAT分析により、緑膿菌リポ多糖（LPS）の生合成に関与するいくつかの酵素が嫌気性増殖中に高レベルで発現されたことが示された（表1）。1). これらには、脂質A脂肪酸をヒドロキシル化するβ-ヒドロキシラーゼLpxo2のホモログ（14）、LPSコアヘプトシルトランスフェラーゼWaaCおよびWaaF（2、15）、および長いBバンドO抗原の合成に関与する遺伝子クラスターによってコードされているWbpGが含まれていた。 これらの結果は，ｌｐｓ含量が嫌気性菌症の結果として変化する可能性があることを示唆している。

要約すると、緑膿菌プロテオームは嫌気性成長中に有意に変化する。 我々は合計で617タンパク質を同定した：ICAT分析によって610、SDS-PAGE分析によって4、および3 2Dページ分析によって。 617同定されたタンパク質のうち、158の存在量は、嫌気的に成長し、好気的に成長した細胞の間で変化した。 Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは好気性成長条件下よりも嫌気性成長条件下で低い細胞密度に達したので，蛋白質発現の密度依存的変化は嫌気性成長中に検出されたプロテオームに寄与している可能性がある。 それにもかかわらず、細菌の細胞密度は、複数の栄養素（酸素を含む）が不足している多くの環境ニッチにおいて同様に制限される可能性が高い。 したがって、我々が検出したタンパク質レベルの変化は、細菌のプロテオームと代謝状態が異なる環境に応答してどのように変化するかの理解に貢献 細菌タンパク質含有量の直接分析は、CF気道を含む特定の環境ニッチへの細菌の適応を観察するための堅牢な技術です。