재료 및 방법
이중 DNA 준비합니다. 2 개의 올리고뉴클레오티드를 혼성화하였다. 올리고뉴클레오티드 5′-지글타트가갓타그가가카그-3’은 그의 5’말단에 사이오닉 5 로 표지되었고,그의 3’말단에 사이오닉 3 으로 표지되었다. 상보적인 올리고 뉴클레오티드는 양쪽 끝에 비오틴으로 표지되었다.
단백질 발현 및 정제. 2015 년 11 월 1 일,미국 캘리포니아주 캘리포니아주 캘리포니아주 캘리포니아주 캘리포니아주 캘리포니아주 캘리포니아주 뉴욕주 캘리포니아주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕주 그 결과 닭 미오신에 대한 플라스미드 코드는 글루에서 잘립니다. 류신 지퍼는 이량 체화를 보장하기 위해 기본 코일 코일을 따랐습니다. 정화를 용이하게하기 위해,미오신 브이 단백질은 엔-말기 태그로 태그되었습니다. 두 개의 재조합 바큘로 바이러스가 단백질 발현을 위해 생성되었다. 이 경우,이 두 가지 유형의 플라스미드는 두 가지 유형의 플라스미드 중 하나입니다. 두 번째 바이러스는 인간의 필수 경쇄를 암호화했습니다. 두 바이러스 모두 기포 9 세포의 공동 감염에 사용되었습니다. 상기 단백질은 스위니 등에 의해 설명된 바와 같이 발현되고 정제되었다. (20).
칼모두린 라벨링 및 교환. 성게 칼모듈린에 단일 시스테인을 도입하였다. 이 칼모듈린은 대장균으로 발현되었고 참조에 설명된 대로 정제되었다. 21. 1.4 배 몰 비율로 20 분 동안 표 시하였다. 과량의 염료를 겔 여과에 의해 교환 완충액(아래)으로 제거한 후,바이오 비드(바이오-라드)상으로 밤새 소수성 흡수를 하였다. 102%,105%,105%,105%,100%,100%,100%,100%,100%,100%,100% 분취량은-80 에서 저장되었습니다.
라벨링된 칼모둘린을 미오신 5 세 상으로 교환하는 것은 설명된 바와 같이 수행되었지만,일부 변형(22)으로 수행되었다. 본 발명은 미오신(150 뉴메틸)과 카모듈린(150 뉴메틸)의 상호 교환 완충액(150 뉴메틸)및 카모듈린(150 뉴메틸)의 상호 교환 완충액(150 뉴메틸)과 카모듈린(150 뉴메틸)의 상호 교환 완충액(150 뉴메틸)을 배양하였다. Exchange calmodulins,0.9mM CaCl2 추가되었 및 혼합물에서 배양 22°C for5min. 반응을 7 밀리미터로 급냉시켰다. 상기 반응 혼합물을 과량의 칼모듈린으로부터 미오신 브이를 정제하기 위해 동일한 부피로 3 회 세척하였다.
유동 전지 제조. 유동 셀은 유리 현미경 슬라이드와 고도의 굴절 커버 슬립으로 제작되었습니다.본 발명의 실시예에 의하면,상기 유세포는 유세포에서 2 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후,유세포에서 30 분 동안 배양한 후, 15 마이크로리터의 뉴트라비딘(분자 프로브)을 세포에 첨가하고,2 분 동안 배양하도록 허용한 후,또 다른 세척을 완충액으로 하였다. 유동 세포를 15 개의 바이오티닐화된 팔로 이딘 액틴 필라멘트(250 나노미터)로 5 분 동안 배양하고,이어서 100-아비 완충액으로 세척 하였다. 마지막으로,세포되었으로 20µl 영상의 버퍼 포함 calmodulin-교 myosin V,5μm calmodulin,300nM ATP,ATP 재생지 시스템(0.1mg·ml-1 크레아틴 인산활성효소/1mM 의 크레아틴산염),0.5%(vol/vol)Triton-X100 을 줄이 비특이적 구속력이 있습니다. 셀을 진공 그리스로 밀봉하고 즉시 이미지화 하였다. 최종 모터 농도는 희박하게 장식 된 액틴을 초래하여 단일 미오신 5 분자를 분석 할 수있었습니다.이 실험에서,바이오틴과 뉴트라비딘은 미오신 브이 실험과 동일한 방식으로 적재되었으나,세척은 완충액(10 밀리미터 트리스,산도 8.0/50 밀리미터)으로 수행되었다. 유세포가 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후,15 개의 뉴트라비딘 코팅을 한 후, 그런 다음 플로우 셀을 진공 그리스로 밀봉하고 신속하게 이미지화했습니다. 표면에 유전자 분자의 결과 장식 충분히 스파스 다른 분자에서 형광 명소 거의 중복 했다.
현미경 설정. 총 내부 반사 형광(티프)현미경은 참조에 설명 된대로 설정되었습니다. 8,일부 수정(그림. 5.정보주체의 권리*의무 및 그 행사방법 여기 소스 빔 532 나노 미터(코 히어 런트,산타 클라라,캘리포니아)및 633 나노 미터(코 히어 런트,산호세,캘리포니아)이색 거울에 의해 결합 하 고 7 밀리미터 직경으로 확장 했다. 이러한 소스(초점 거리=500 밀리미터)올림푸스 1.65 의 후면 초점 평면에 초점을 맞추었다. 목표는 위치 측정을위한 용량 성 센서가 장착 된 폐쇄 루프,2 축 압전 나노 변환 단계 아래에 배치되었습니다. 대물 후면 조리개를 빠져나오는 반사광은 쿼드런트 포토다이오드에 전달되어 대물 및 샘플 사이의 거리를 전계 액추에이터(뉴포트,파운틴 밸리,캘리포니아)로 고정하는 초점 피드백 루프에 대한 신호를 제공했습니다. 형광 배출 통해 수집한 목적,전달을 통한 두 가지 StopLine 얇은 필름을 수준의 필터(Semrock,Rochester,NY)에서 각각 자극 소스를 통해 전달되는 듀얼-전기구는 허용되는 동시에 이미징의 Cy3 및 Cy5 채널에 단일 iXon DV887EMCCD 카메라(노 기술,벨파스트,북 아일랜드). 모든 데이터는 0.5 초의 통합 시간으로 이미징되었습니다. 두 채널 사이의 누화(10%)는 아마도 거리 측정을 더 작은 값으로 편향시킬 것입니다. 그러나 우리의 실험 오류,,그것은 감지할 수 없는,몬테카를로 시뮬레이션에 의해 표시 된 100 쌍 10 나노에 의해 분리 된 단일 플루오로 포어의 모델링 된 이미지의 생성 및 분석 데이터(아래 설명)와 동일 하 게 렌더링 합니다. 형광 포인트 확산 함수의 시뮬레이션된 이미지 샷된 노이즈가 추가 된 일정 한 배경으로 통합된 2 차원 가우시안 강도 분포를 생성 하 여 계산 했다. 시뮬레이션 된 피크는 실제 피크와 동일한 치수 및 신호 대 잡음비를 가졌습니다. 크로스토크가 10%인 시뮬레이션 된 데이터와 크로스토크가없는 시뮬레이션 된 데이터는 콜 모고 로프-스 미르 노프 테스트(엔 1=100,엔 2=100,피>0.05)로 구별 할 수 없습니다.
데이터 분석. 100 나노 트랜스 플루오 스피어 비드(분자 프로브)로 구성 된 수탁자와 함께 수행 되었다. 그들은 532 나노 미터에 흥분했고,그들은 광범위한 방출 스펙트럼으로 방출합니다. 구슬은 우리 채널 모두에서 감지 할 수있었습니다. 우리는 커버슬립과 관련된 하나의 비드를 찾았고,우리의 피에조 스테이지와 함께 우리는 그리드 패턴(0.5-000 미터 간격)에서 나노 미터 정밀도로 그것을 밟아 매 정류장에서 이미지를 찍었습니다. 최종 결과는 서로 다른 위치에서 두 채널의 비드를 보여주는 312 개의 이미지 스택이었습니다(그림 1). 1).
DNA 데이터를 분석하여 만든 소프트웨어를 사용하여 matlab(Mathworks,Natick,MA). 이 루틴은 높은 강도의 픽셀을 결정하여 이미지에서 피크를 자동으로 찾아 내고 주변 픽셀이 단일 형광 단자에 대해 예상되는 강도를 갖도록합니다. 피크를 2 차원 가우시안 함수에 맞추기 전에 중심 위치를 얻기 위해 피크 쌍을 검색합니다. 상기 화소들은 상기 화소들 내에 있는 화소들을 상기 화소들 상에 맵핑하고,주변 화소들 내의 피크들에 대한 검색이 수행된다. 피크가 발견되면 사이 5 피크와 사이 3 피크는 추가 분석을 위해 한 쌍으로 간주됩니다. 각 피크는 위의 구슬에 대해 설명 된대로 각각의 공간에서 2 차원 가우스 함수에 적합합니다(식. 1 ). 광자(뉴욕)수집,
의 수와 적합 평균 위치에 오류가 계산 됩니다. 그 후,확인된 플루오로포어 쌍들은 쌍들의 분석에 방해가 될 다른 플루오로포어에 근접하지 않았는지 확인하기 위해 수동으로 스크리닝되었다.
미오신 브이 데이터를 먼저 눈으로 움직이는 모터를 식별하여 분석 하였다. 위에서 설명한 바와 같이 형광 피크의 시작 쌍을 2 차원 가우스 함수에 맞추고 사용자가 지정한 기간 동안 피크를 계속 추적했습니다. 그 활용된 염료 각 단일 단계에서 표 백 모터 분석 했다,관찰 하는 모터의 대부분에 대 한 경우와 같이 우리가 실제로 하나의 세포막 3 레이블 및 하나의 세포막 5 레이블 모터를 공부 했다 보장. 결과 궤적 사이 3 채널에 5 탄도를 매핑 하 여 등록 했다. 적어도 사각형 선형 두 궤도에서 지점에 맞게 궤적 투영 했다 액틴 필 라 멘 트의 방향을 했다. 선형 적합을 따른 거리(액틴 필라멘트)는 헤드의 상대 거리를 확인하기 위해 시간에 대해 플롯되었습니다(그림 1). 4).
액틴 필라멘트를 따라 걷는 차동적으로 표지된 미오신 대 분자의 시간 추적. 이 라벨은 미오신 5 분자 상으로 교환된 칼모둘린에 공유적으로 부착된다. 이 추적에서 형광 프로브의 두 위치는 72 나노 미터 단계를 취하고 있으며,이는 칼모둘린이 모터 도메인에 가깝게 교환되었음을 나타냅니다. 프로브의 교대 위치는 미오신 브이의 핸드 오버 핸드 보행 메커니즘을 직접 관찰 할 수 있습니다.