키나아제 활성 태그 웨스턴 블로 팅 분석

축적 된 증거는 인산화/탈 인산화 신호 전달의 중단이 세포의 병리학 적 행동과 관련이 있음을 시사합니다. 포스 포-프로테옴 프로젝트는 세포 단백질에서 거의 300,000 개의 인산화 된 잔류 물을 확인했습니다. 동시에 인간 게놈 프로젝트는 약 500 개의 단백질 키나제를 밝혀 냈습니다. 아직,단백질 키나제의 한정된 수는 각 인산화 위치에 할당되었습니다.

인-겔 인산화 분석은 단백질 키나제 활성을 검출하기 위한 편리한 방법이었다. 이 방법은 다음과 같은 경우에 적용됩니다. 이 분석 프로토콜에서 단백질 키나제는 기질 폴리펩티드와 함께 내장 된 폴리 아크릴 아미드 겔에 적재 된 다음 재생성,인산화를 사용하여 방사성 인산화,인산화 된 기질을 검출하기 위해자가 방사선 촬영. 또한,니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 막에서 키나아제의 자가 인산화가 검출되었다. 방사성 물질은 안전 규정으로 인해 사용자에게 제한 될 수 있습니다. 또한,인산화 단백질의자가 방사선은 인산화 부위에 대한 정보가 부족합니다.

여기서,우리는 전통적인 인 겔 인산화 분석에 대한 비 방사성 대체 분석을 최적화했습니다. 또한,특정 부위에 관심이 있는 기질 단백질을 인산화시키는 티르-키나아제를 성공적으로 검출합니다.

그림 1KAT-WB 에 대한 데이터 Tyr-kinase autophosphorylation 분석하지 않아도 됩니다. 을 중복도 말,두 부분 표본 추출되었으로 로드하는 SDS 폴리아크릴아미드 겔,을 실시하는 전기 이동법,그리고 다음 단백질 전송에 장 PVDF 막(0.2µm). 상기 막을 순차적으로 완충된 2-프로판올,6.0 엠 구아니딘 히드로클로라이드,3.0 엠 구-히드로클로라이드,0.1 엠 구-히드로클로라이드 및 재생 완충액으로 처리하였다(보충 프로토콜 참조). 상기 멤브레인을 길이 방향으로 절단하여 2 개의 중복된 조각을 생성하였다(그림 1). 한 조각의 막을 60 분 동안 배양하였다. 막의 다른 조각을 제어로서 엠갓피 없이 배양하였다. 두 시트를 동시에 항-피-티르 항체로 면역 검출 하였다(1:5000 희석시 클론 피 20). 도 1 에 도시 된 바와 같이,다수의 피-티르 밴드가 제어 막(왼쪽 상단)에서 100,70,45 및 35 에서 검출되었다. 이러한 피-티르 단백질은 아마도 추출 전에 이미 인산화되었을 것입니다. (그림 1,오른쪽 상단,레인 2),재생 후 막이 키나아제에 티르 잔기의 자가 인산화를 나타내는. 그림 1 은 차선 2 의 밀도계를 보여줍니다. 두 오점에 단백질의 동등한 로딩을 확인하기 위해,필터는 쿠마시 염색(그림 1,바닥)을 실시 하였다. 기술 참고,방법을 개발 하는 과정에서 우리가 발견 버퍼링 된 2-프로판올 및 6 와 치료 키나 제 활동의 탐지에 필요한 했다. 이 경우,이 약물은 항 염증 효과가 있습니다.

키나아제에 근접하여 폴리프로필렌 막에 흡수된 기질 단백질의 사이트 특이 적 인산화를 사용한다. 우리는 포스파타제 홀로엔자임 억제제-1(피-1)을 관심 단백질로 사용했습니다. 본 발명의 다른 실시예는 표 1 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 바와 같이,표 2 에 도시된 상기 변성 및 단계적 재생 공정 후,상기 멤브레인을 상기 재조합 피 -1 야생형(중량)또는 비인산성 버전으로 보충된 재생 완충액에서 밤새 담갔다가,상기 멤브레인을 상기 인산화 반응을 엠갓피에서 실행하였다. Phosphorylated PHI-1 막에서 발견되었을 사용하여 anti-P-PHI-1(Thr57)항체,그리고 이 공개 밴드의 재조합 ZIPK. 그러나,단지 감도불량한 신호는 파이-1 없이 통제 막에 또는 파이-1 의 57 시간 버전으로 검출되었습니다. 이 데이터는 막에 재생성 키나제가 또한 막에 흡수되는 기질을 인산화할 수 있다는 것을 건의합니다. 조직 및 세포에서 여러 개의 피 -1 키나아제를 검출하기 위해 캣-바이알을 적용 하였다(그림 2 비). 쥐 골격근,심장근 및 신경근 세포로부터 추출된 추출물들을 캣우먼의 분석실험을 실시하였다. 2015 년 1 월 1 일,2015 년 1 월 1 일,2015 년 1 월 1 일,2015 년 1 월 1 일,2015 년 1 월 1 일,2015 년 1 월 1 일,2015 년 1 월 1 일,2015 년 1 월 1 일 세포 용 해물(레인 3,열린 화살촉)에서 검출되었다. 그러나,피-피-1 에 대 한 밴드 골격과 심장 근육(레인 1 과 2)의 추출 물 차선에서 분명 했다. 피-피-1 신호는 피-1 없이 인산화 단계에 의해 강화되지 않았다(그림 2,바닥,블랭크:블랭크). 이러한 결과 여러 피 -1 키 니 아 제 신경 세포 하지만 골격 또는 심장 근육에 표현 하는 것을 보여줍니다. 이것은 세포와 조직에 있는 다수 기질 특정한 키나제를 검출하기를 강력한 공구를 저희에게 제공합니다. 기술 참고 피-1 하룻밤 재포화 인산화 신호의 검출에 필요한 고 피-1 의 높은 농도 염색 강도(표시 되지 않음)증가 하지 않았다.

이러한 데이터를 바탕으로,우리는 캣-비스 티르 키나제의 자동 인산화 및 여러 단백질 키나제에 의해 관심의 선택적 기질 단백질의 사이트 특정 인산화 조직 및 세포에 존재 하는 검출 할 수 있다 제안 합니다. 캣-바이알은 본질적으로 자신의 분자 크기를 노출,이러한 세포 추출물과 같은 조 혼합물에 키나제 활성을 검출 전통적인 인-겔 인산화 분석법의 장점을 공유한다. 이 두 분석실험의 또 다른 장점은 세포 내의 키나아제의 번역 후 변형은 특정 조건 하에서 원하는 시점에 보존될 수 있다는 것이다. 대부분의 단백질 키나제는 다음을 통해 조절됩니다. 키나아제 활성의 변동을 모니터링할 수 있습니다. 때문에 고용 조건 하에서 효과적으로 재생 단량체 효소 쇼 활동. 그러나,캣-바이알의 변형은 칼모듈린 및 사이클린에 의해 조절되는 키나제를 검출할 수 있어야 하는데,이는 겔 내 인산화 분석에 의해 수행되었기 때문이다. 재생 효율의 개선 및 키나제에 대한 항체와의 면역 침강/면역 절제와의 조합은 접근법의 유용성을 확장 할 수 있습니다.

그것은 주목할 만하는 외에,산화,원칙의 캣-WB 프로토콜에 적용될 수 있습의 탐지를 위한 다른 PTM 효소,같은 acetylases,methylases 및 ubiquitin ligases 때 PTM-특정 항체를 사용할 수 있습니다. 사이트 특이 적 뇌척수액을 인식하는 항체의 개발과 함께,활동 태그 웨스턴 블로 팅에 의해 덮여 연구 목표를 확장 할 것입니다.