DNA Gel Elektroforese ER en teknikk som brukes til å skille OG identifisere DNA-fragmenter basert på størrelse.
DNA – fragmenter av forskjellige størrelser lastes inn i en porøs gel laget av agarose-et karbohydrat som finnes i røde alger.
når et elektrisk felt påføres, vil fragmentene migrere gjennom gelen, takket være de negativt ladede fosfatgruppene I DNA-nukleotider.
Mindre BITER AV DNA vil lettere migrere gjennom gelen enn større fragmenter, som har en vanskeligere tid å bevege seg gjennom gelmatrisen.
når gelkjøringen er fullført, kan plasseringen av DNA-prøvene sammenlignes med en serie fragmenter eller bånd av kjente størrelser, kalt EN DNA-stige.
tilstedeværelsen av fragmentet av interesse kan da bekreftes basert på størrelsen, som bestemmes ved å sammenligne den relative plasseringen av prøven med fragmentene av stigen.
Agarosegeler fremstilles ved bruk av en vekt over volumprosentløsning. Så 1 gram agarose i 100 ml buffer vil gjøre en 1% gel. Lavere prosent gels vil bedre løse større fragmenter og høyere prosent gels vil gjøre mindre fragmenter lettere å identifisere. For å starte gelfremstillingsprosedyren, veie ut riktig masse agarose i En erlenmeyer-kolbe.
Legg til løpende buffer i kolben, slik at volumet av buffer ikke er større enn 1/3 av kolbens kapasitet. Deretter virvel for å blande.
Smelt agarose/bufferblandingen ved oppvarming i mikrobølgeovn med maksimal effekt. Hver tretti sekunder, fjern kolben og virvle innholdet for å blande godt. Gjenta til agarosen er helt oppløst.
deretter tilsettes etidiumbromid til en konsentrasjon på 0,5 mg/ml. Etidiumbromid er en aromatisk forbindelse som passer inn mellom individuelle basepar AV DNA, eller interkalater, og forårsaker AT DNA avgir intens oransje fluorescens under UV-lys. Det er viktig å merke seg at etidiumbromid er kreftfremkallende, så hansker bør alltid brukes ved håndtering av geler som inneholder denne forbindelsen.
la agarosen kjøle seg ned ved Å plassere den i et vannbad PÅ 65º.
som agarosen kjøler, klargjør gelformen ved å plassere gelbrettet i støpeapparatet. Som et alternativ kan du bruke tape til å forsegle de åpne kantene på gelbrettet for å lage formen. Plassering av en kam i gelen skaper brønnene DER DNA er lastet. Sørg for at kammen vil skape en brønn som er riktig størrelse FOR DIN DNA-prøve.
Hell den smeltede agarosen i gelformen og la den herdes ved romtemperatur.
etter at agarosen har herdet, ta ut kammen. Hvis gelen ikke skal brukes umiddelbart, pakk den inn i plastfolie og oppbevar den PÅ 4º til bruk.
hvis gelen skal brukes umiddelbart, legg den i gelboksen.
for å starte denne prosedyren, legg til gelbelastende fargestoff TIL DNA-prøvene som skal skilles. Lasting fargestoff er vanligvis laget PÅ EN 6x konsentrasjon. Lasting av fargestoff bidrar til å visualisere og laste prøver inn i brønnene og bidrar til å bestemme hvor langt prøvene har migrert under løp.
Still strømforsyningen til ønsket spenning.
legg nå nok løpende buffer i gelboksen for å dekke overflaten av gelen. Pass på at du bruker samme kjørebuffer som den som brukes til å forberede gelen.
Koble ledningene til gelboksen til strømforsyningen og slå den på. HUSK AT DNA er negativt ladet og vil bevege seg mot anoden, som er positiv, og generelt rød i fargen. Pass på at du ikke kobler den svarte ledningen eller katoden til bunnen av gelboksen. Så du ikke glemmer, husk at svarte katter er uflaks, eller negativ, og den svarte Katoden er derfor negativ. Kjør gel til rød, eller anoden. For å verifisere at både gelboksen og strømforsyningen fungerer; utseendet på bobler ved elektrodene indikerer at strømmen går gjennom.
Fjern lokket på gelboksen. Legg LANGSOMT OG forsiktig DNA-prøvene inn i gelen. Igjen, lasting fargestoff i prøven tillater prøven å synke ned i gel og vil bidra til å spore hvor langt prøven har reist. EN DNA størrelse markør, eller stige, bør alltid lastes sammen med eksperimentelle prøver.
Sett på lokket Igjen. Dobbeltsjekk at elektrodene er koblet til de riktige sporene i strømforsyningen.
Slå på strømmen. Kjør gelen til fargestoffet har migrert til en passende avstand.
når elektroforese løp er fullført, slå av strømforsyningen og fjern lokket på gelboksen.
Fjern gelen fra gelboksen og tøm overflødig buffer på overflaten av gelen. Plasser gelskuffen på papirhåndklær for å absorbere eventuell gjenværende buffer.
for å visualisere DNA-fragmentene, fjern gelen fra gelbrettet og utsett gelen for ultrafiolett lys.
DNA-fragment skal dukke opp som oransje fluorescerende bånd. Ta et bilde av gelen.
på slutten av forsøket, kast gelen og kjørebufferen på riktig måte per institusjonsforskrifter. Igjen, husk å alltid håndtere gel og kjører buffere med hansker for å unngå etidiumbromid eksponering.
Nå som du har sett HVORDAN DU utfører DNA gel elektroforese. La oss ta en titt på noen nedstrøms programmer og varianter av denne svært nyttig metode.
her ser du et resultat av agarose gelelektroforese etter separering AV PCR-produkter. DNA-fragmentene lastet inn i gelen er synlige som klart definerte bånd. DNA-standarden eller stigen skal skilles i en grad som muliggjør den nyttige bestemmelsen av størrelsene på prøvebåndene. I dette eksemplet separeres DNA-fragmenter av 765 basepar, 880 basepar og 1022 basepar på en 1,5% agarosegel med EN 2-log DNA-stige.
i tillegg til å bekrefte tilstedeværelsen AV ET DNA-fragment av interesse, KAN DNA-gelelektroforese kombineres med gelrensingsprosedyrer. Vanligvis brukes et barberblad til å kutte UT DNA-fragmentet av interesse, slik at DET kan samles inn og DNA-prøven i den gjenvinnes.
agarose gel elektrofese kan også kombineres med overføringsblotting, som innebærer at DNA eller RNA kan overføres til en cellulosemembran hvor radioaktive prober kan brukes til å identifisere spesifikke DNA – eller RNA-sekvenser i din elektroforetisk separerte prøve.
Standard DNA gel elektroforese er ikke ideelt for separasjon AV HØY molekylvekt DNA større enn 15-20 kb i størrelse, som genomisk DNA. For å skille store DNA-prøver brukes pulsfelt gelelektroforese, som innebærer å underkaste gelen til et skiftende eller pulserende elektrisk felt i forskjellige retninger. Denne teknikken innebærer et spesialisert gel-løpende apparat, som har par elektroder plassert i forskjellige retninger rundt gelen. Dette kan brukes til å oppdage forskjeller i genomstørrelser mellom populasjoner av organismer, som de samlede DNA-prøvene fra forskjellige mikrobielle samfunn, ser du her som er tatt fra forskjellige innsjømiljøer.
Du har nettopp sett en introduksjon TIL DNA gel elektroforese. Vi viste deg konseptet bak metoden, hvordan å forberede agarose gel, hvordan å laste prøvene, hvordan du kjører gel, og analysere det og noen vanlige anvendelser av agarose gel elektroforese. Takk for at du ser og lykke til med å kjøre gelen din.