Enkelt molekyl høyoppløselig kolokalisering Av Cy3 Og Cy5 festet til makromolekyler måler intramolekylære avstander gjennom tid

Materialer Og Metoder

Dupleks DNA Forberedelse. For å lage 30-bp duplex DNA-molekylene ble to oligonukleotider med følgende sekvens og modifikasjoner hybridisert(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotid 5′-GGGTATGGAGATTTTTAGCGGAGTGACAGC-3 ‘ble merket Med Cy5 ved sin 5 ‘ ende og Med Cy3 ved sin 3’ ende. Det komplementære oligonukleotid ble merket med biotin i begge ender.

Proteinuttrykk og Rensing. Det gule fluorescerende proteinet (YFP) genet i p2Bac / pFastBac-YFP-M5-CaM plasmid (en gave Fra H. Lee Sweeney, University Of Pennsylvania, Philadelphia) ble slettet AV PCR. Den resulterende p2Bac / pFastBac-M5-CaM plasmid koder for kylling myosin V som er avkortet Ved Glu-1099. En leucin glidelås fulgte den innfødte spiralspolen for å sikre dimerisering. For å lette rensingen ble myosin V-proteinet n-terminalt merket MED EN FLAGG-tag (DYKDDDDK). To rekombinante baculovirus ble generert for proteinuttrykk i Sf9-celler. En kodet den avkortede myosin V og Drosophila melanogaster calmodulin avledet fra p2Bac / pFastBac-M5-CaM plasmid. Det andre viruset kodet human essential light chain avledet fra p2Bac / pFastBac-ELC plasmid. Begge virusene ble brukt til koinfeksjon Av Sf9-celler. Proteinet ble uttrykt og renset som beskrevet Av Sweeney et al. (20).

Calmodulin Merking og Utveksling. Calmodulin ble uttrykt Og merket Med Cy3 Eller Cy5 som følger: en enkelt cystein ble introdusert i kråkebolle calmodulin ved hjelp AV mutasjonen Q143C. Denne kalmodulin ble uttrykt I Escherichia coli og renset som beskrevet i ref. 21. Calmodulin ble merket Med Enten Cy3-maleimid eller Cy5-maleimid (Amersham Biosciences) lagerløsninger (I DMSO) med et 1,4 ganger molarforhold i 20 minutter. Overflødig fargestoff ble fjernet ved gelfiltrering i utvekslingsbuffer (under), etterfulgt av hydrofob absorpsjon over natten På BioBeads (Bio-Rad). Inkorporering av etiketten var 102% For Cy3-calmodulin og 75% For Cy5-calmodulin. Alikvoter ble lagret på -80°C.

utvekslingen av merket calmodulin på myosin V ble utført som beskrevet, men med noen modifikasjoner (22). Myosin V (150 nM) ble inkubert med 0,7 nM Cy3-merket calmodulin og 0,8 nM Cy5-merket calmodulin i utvekslingsbuffer (25 mM KCl / 20 mM imidazol HCl, pH 7,4 / 2 mM MgCl2 / 1 mM EGTA) ved 22°C i 2 min. For å bytte calmodulins ble 0,9 mM CaCl2 tilsatt og blandingen ble inkubert ved 22°C i 5 min. Reaksjonen ble slukket med 7 mM EGTA. Reaksjonsblandingen ble påført PÅ EN 100k Mwco Nanocep ultrafiltreringsenhet (Pall) og vasket tre ganger med like mengder AB (under) for å rense myosin V fra overflødig kalmodulin.

Flytcellepreparering. Strømningscellen ble konstruert med et glassmikroskopglass og svært refracting dekkglass laget AV NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) holdt sammen av biter av dobbeltsidig Scotch tape.

for myosin V-forsøkene ble 15 µ biotin-BSA (1 mg·ml-1) inkubert i strømningscellen i 2 minutter, hvoretter 30 µ ab-buffer (25 mM KCl/25 mM imidazol HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) ble ført gjennom strømningscellen for å vaske den ut. Femten mikroliter av 0.5 mg/ml NeutrAvidin (Molekylære Prober) ble tilsatt til cellen og fikk lov til å inkubere i 2 min, hvorpå en annen vask ble gjort MED AB buffer. Strømningscellen ble inkubert med 15 µ av biotinylerte phalloidinaktinfilamenter (250 nM) i 5 min, etterfulgt av en 100-µ vask med AB buffer. Til slutt ble cellen lastet med 20 µ bildebuffer inkludert calmodulin-utvekslet myosin V, 5 µ calmodulin, 300 nM ATP, ET ATP-regenereringssystem (0,1 mg·ml-1 kreatinfosfokinase/1 mM kreatinfosfat) og 0,5% (vol/vol) Triton-x 100 for å redusere ikke-spesifikk binding. Cellen ble forseglet med vakuumfett og avbildet umiddelbart. Den endelige motorkonsentrasjonen resulterte i tynt dekorert aktin og tillot dermed en analyse av enkle myosin V-molekyler.

for DNA-forsøkene ble biotin-BSA og NeutrAvidin lastet på samme måte som for myosin V-forsøkene, men vaskene ble gjort Med T50 buffer (10 mM Tris, pH 8.0/50 mM NaCl). Når strømningscellen hadde Et Neutravidindrasjering, ble 15 µ dsdna (30 nM) i T50-buffer med 1 mg·ml-1 BSA strømmet inn og inkubert i 2 min, hvoretter 100 µ av bildebehandlingsbuffer ble strømmet inn. Strømningscellen ble deretter forseglet med vakuumfett og raskt avbildet. Den resulterende dekorasjonen AV DNA-molekyler på overflaten var tilstrekkelig sparsom at fluorescerende flekker fra forskjellige molekyler sjelden overlappes.

Mikroskop Oppsett. TOTAL intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskop ble satt opp som beskrevet i ref. 8, med noen modifikasjoner (Fig. 5, som er publisert som støtteinformasjon på PNAS nettsted). Eksitasjonskildebjelker ved 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) og 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) ble kombinert med et dikroisk speil og utvidet til en 7 mm diameter. Disse kildene var fokusert (brennvidde = 500 mm) på baksiden fokalplanet Av En Olympus 1.65 NA ×100 TIRF objektiv ved hjelp av en laser linje dikroisk på en lineær oversettelse scenen som tillater mikroskop drift i enten epifluorescens eller TIRF moduser. Målet ble plassert under en lukket sløyfe, to-akse, piezo nanotranslation scenen utstyrt med kapasitive sensorer for posisjonsmåling (Physik Instrumente, Auburn, MA). Det reflekterte lyset som forlot objektivets bakåpning ble rettet på en kvadrantfotodiode for å gi et signal for en fokus tilbakemelding sløyfe som klemmet avstanden mellom målet og prøven med en elektrostriktiv aktuator (Newport, Fountain Valley, CA). Fluorescensutslipp ble samlet inn av målet, passert gjennom to Stopplinjefilmfiltre (Semrock, Rochester, NY), en for hver eksitasjonskilde, og overført gjennom et dual-view-apparat som tillot samtidig avbildning Av Cy3-og Cy5-kanalene på et enkelt IXON DV 887 EMCCD-kamera (Andor Technology, Belfast, Irland). Alle data ble avbildet med en 0,5 sek integrasjonstid. Crosstalk mellom de to kanalene (10%) formodentlig forstyrrer avstandsmålinger mot mindre verdier. Vår eksperimentelle feil gjør det imidlertid uoppdagelig, som Vist Ved Monte Carlo-simuleringer hvor 100 par modellerte bilder av enkeltfluoroforer separert med 10 nm ble opprettet og analysert identisk som MED DNA-dataene (beskrevet nedenfor). Simulerte bilder av fluorescerende punktspredningsfunksjoner ble beregnet ved å generere en integrert 2d gaussisk intensitetsfordeling med en konstant bakgrunn som skuddstøy ble lagt til. De simulerte toppene hadde samme dimensjoner og signal-til-støy-forhold som de virkelige toppene. Simulerte data med 10% crosstalk og simulerte data uten crosstalk kan ikke skelnes av En Kolmogorov-Smirnov-test (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).

Dataanalyse. En registrering kartlegging Av Cy3 Og Cy5 kanaler ble utført med fiducials bestående av 100-nm TransFluoSphere perler (Molekylære Prober). De var begeistret ved 532 nm, og de avgir med et bredt utslippsspekter. Perlen var detekterbar i begge våre kanaler. Vi fant en enkelt perle knyttet til dekkglasset, og med vår piezo-scene trappet vi den med nanometerpresisjon i et rutenettmønster (med en 0,5-µ avstand), og tok et bilde ved hvert stopp. Sluttresultatet var en stabel med 312 bilder som viser perlen i begge kanaler i forskjellige posisjoner(Fig. 1a).