Aktywność kinazy oznaczony western blotting test

gromadzenie dowodów sugeruje, że zakłócenia w sygnalizacji fosforylacji/defosforylacji są związane z patologicznymi zachowaniami komórek. Projekty Phospho-proteome zidentyfikowały prawie 300 000 fosforylowanych reszt Ser / Thr / Tyr w białkach komórkowych . Równolegle w ramach projektu ludzkiego genomu odkryto około 500 kinaz białkowych. Jednak ograniczona liczba kinaz białkowych została przypisana do każdego miejsca fosforylacji.

test fosforylacji w żelu był wygodną metodą wykrywania aktywności kinazy białkowej w próbkach rozpuszczonych SDS. Metoda ta została zastosowana do identyfikacji CaMKII, MYPT1-K (lub ZIPK) i innych . W tym protokole testu kinazy białkowe są ładowane na żel poliakrylamidowy SDS osadzony z polipeptydem substratowym, a następnie poddawane renaturacji, fosforylacji przy użyciu radioaktywnego ATP, a następnie autoradiografii w celu wykrycia fosforylowanego substratu. Ponadto wykryto autofosforylację kinaz na błonie nitrocelulozy lub fluorku poliwinylidenu (PVDF) przy użyciu radioaktywnego ATP . Materiał promieniotwórczy może być ograniczeniem dla użytkowników, ze względu na przepisy bezpieczeństwa. Ponadto autoradiogramy fosforylowanych białek nie zawierają żadnych informacji o miejscach fosforylacji.

tutaj zoptymalizowaliśmy nieradioaktywny test alternatywny do tradycyjnego testu fosforylacji w żelu. Nazwany aktywności kinazy western blotting (Kat-WB), to skutecznie wykrywa Tyr-kinazy, które autofosforylują się, jak również Ser/Thr-kinazy, które fosforylują białko substratowe interesujące w określonym miejscu przy użyciu przeciwciał specyficznych dla fosfo (P).

Fig. 1 przedstawia dane KAT-WB dla testu autofosforylacji kinazy Tyr. Aby uzyskać zduplikowane plamy, dwie porcje ekstraktu załadowano na żel poliakrylamidowy SDS, poddano elektroforezie, a następnie białka przeniesiono na arkusz membrany PVDF(0,2 µm). Membranę traktowano kolejno buforowanym 2-propanolem, 6,0 m chlorowodorkiem guanidyny (gu-HCl), 3,0 M gu-HCl, 0,1 m gu-HCl i buforem renaturacji (patrz protokół uzupełniający). Po nocnym etapie renaturacji w temperaturze 4°C, membranę przecięto wzdłuż w celu wytworzenia dwóch duplikatów (ryc. 1). Jeden kawałek membrany inkubowano przez 60 minut z 1 mM MgATP. Drugi fragment membrany inkubowano bez MgATP, jako kontrolny. Oba arkusze poddano jednocześnie immunodetekcji przeciwciałem anty-P-Tyr (klon PY20 w rozcieńczeniu 1:5000). Jak pokazano na fig. 1, wykryto wiele pasm P-Tyr przy 100, 70, 45 i 35 kDa w membranie kontrolnej (lewy górny róg). Te białka P-Tyr prawdopodobnie były już fosforylowane przed ekstrakcją. Inkubacja z MgATP po rozdzieleniu zwiększyła fosforylację Tyr białka przy 45 kDa w lizatach mięśnia sercowego (Fig.1, prawy górny pas 2), co wskazuje na autofosforylację reszt Tyr w tej kinazie na błonie po renaturacji. Rysunek 1 przedstawia densytogramy pasa 2 (- /+MgATP). Aby zweryfikować równoważny ładunek białka na dwóch plamach, filtry poddano barwieniu Coomassie (Fig. 1, dół). Uwaga techniczna jest taka, że w trakcie opracowywania metody stwierdziliśmy, że zabiegi z buforowanym 2-propanolem i 6m gu-HCl były niezbędne do wykrywania aktywności kinazy. Dlatego Kat-WB wykrył kinazę Tyr 45-kDa.

inna wersja Kat-WB wykorzystuje site-specific fosforylacji białka substratu absorbowanego na błonie PVDF w pobliżu kinazy. Jako interesujące białko użyliśmy inhibitora holoenzymu fosfatazy-1 (PHI-1), którego fosforylacja w thr57 przekształca to białko komórkowe w inhibitor fosfatazy Ser/Thr typu 1. 2A przedstawia dane KAT-WB wykorzystujące jako pozytywną kontrolę rekombinowany ZIPK, kinazę Ser/Thr znaną z fosforylacji rekombinowanego PHI-1 w thr57 . Po denaturacji i stopniowym procesie renaturacji membranę moczono przez noc w temperaturze 4°c w buforze renaturacji uzupełnionym rekombinowanym typem dzikim PHI-1 (WT) lub wersją niefosforylowalną (T57H) w temperaturze 0,2 mg/ml, a następnie reakcję fosforylacji prowadzono MgATP. Fosforylowane PHI-1 na błonie wykryto przy użyciu przeciwciała anty-P-PHI-1 (Thr57), co ujawniło pasmo rekombinowanego ZIPK. Jednak tylko słaby sygnał został wykryty na membranach sterujących bez PHI-1 lub z wersją T57H PHI-1. Dane te sugerują, że renaturatowane kinazy na błonie są w stanie fosforylować substraty, które są również absorbowane na błonie. Kat-WB zastosowano do wykrywania wielu kinaz PHI-1 w tkankach i komórkach (Fig.2b). Ekstrakty z kości szczura, mięśni serca i komórek Neuro2a poddano testowi Kat-WB. W porównaniu z kontrolą no-ATP (lewy, górny), sygnały P-PHI-1 pojawiły się na plamce inkubowanej z 1 mM MgATP (prawy, górny). Znaczące pasma P-PHI-1 wykryto w lizatach komórek Neuro2a w stężeniu 100, 60 i 49 kDa (pas 3, otwarty grot strzałki). Jednak nie stwierdzono pasm dla P-PHI-1 W pasie z ekstraktami mięśni szkieletowych i sercowych (Pasy 1 i 2). Sygnał P-PHI-1 nie został wzmocniony przez etap fosforylacji bez PHI-1 (Fig. Wyniki te pokazują, że istnieje wiele kinaz PHI – 1 ulegających ekspresji w komórkach neuronalnych, ale nie w mięśniach szkieletowych lub sercowych. Zapewnia nam to potężne narzędzie do wykrywania wielu kinaz specyficznych dla substratów w komórkach i tkankach. Uwaga techniczna jest taka, że nocna renaturacja za pomocą PHI-1 była konieczna do wykrycia sygnałów fosforylacji, a wyższe stężenie PHI-1 nie zwiększało intensywności barwienia (nie pokazano).

na podstawie tych danych proponujemy, że KAT-WB jest zdolny do wykrywania autofosforylacji kinaz Tyr i fosforylacji specyficznych miejsc selektywnych białek substratowych będących przedmiotem zainteresowania przez wiele kinaz białkowych obecnych w tkankach i komórkach. KAT-WB zasadniczo podziela zalety tradycyjnego testu fosforylacji w żelu, który wykrywa aktywność kinazy w surowej mieszaninie, takiej jak ekstrakty komórkowe, odsłaniając ich rozmiary cząsteczkowe . Inną zaletą tych dwóch testów jest to, że potranslacyjne modyfikacje (PTMs) kinaz w komórkach mogą być zachowane w pożądanym punkcie czasowym w określonych warunkach, ponieważ próbki do tych testów są szybko denaturowane buforem, w tym SDS, eliminując fosforylację i defosforylację w ekstraktach . Większość kinaz białkowych jest regulowana przez PTM. KAT-WB jest w stanie monitorować wahania aktywności kinaz, nawet jeśli regulacyjny PTM nie został jeszcze scharakteryzowany. KAT-WB nie jest w stanie wykryć każdej kinazy w ekstraktach komórkowych, ponieważ aktywność wykazują tylko enzymy monomeryczne, które skutecznie ulegają przemianie w zastosowanych warunkach. Jednakże modyfikacje KAT-WB powinny być w stanie wykryć kinazy regulowane przez kalmodulinę i cykliny, tak jak to miało miejsce w teście fosforylacji w żelu . Poprawa wydajności renaturacji i połączenie z immunoprecypitacją/zmniejszeniem odporności z przeciwciałami dla kinaz może rozszerzyć użyteczność tego podejścia.

warto zauważyć, że oprócz fosforylacji, zasada protokołu KAT-WB może być stosowana do wykrywania innych enzymów PTM, takich jak acetylazy, metylazy i ligazy ubikwityny, gdy dostępne są przeciwciała specyficzne dla PTM. Wraz z rozwojem przeciwciał, które rozpoznają specyficzne dla miejsca PTMs, cele badawcze objęte oznaczoną aktywnością western blotting zostaną rozszerzone.