kinazy białkowe są największą nadrodziną enzymatyczną zaangażowaną w transdukcję sygnału komórkowego i stanowią cele terapeutyczne dla szeregu chorób. Wiele laboratoriów podjęło intensywne wysiłki, aby zrozumieć ich mechanizmy katalityczne, odkryć inhibitory i rozpoznać ich funkcje komórkowe. W tym przeglądzie opiszemy dwa podejścia opracowane do analizy kinaz białkowych: hamowanie analogów bisubstratowych i wykorzystanie analogów fosfonianowych. Obie te metody zostały użyte w połączeniu z metodą półsyntezy białek wyrażoną ligacją białek, aby przyspieszyć nasze zrozumienie interakcji kinaza-substrat i funkcjonalnego wyjaśnienia fosforylacji. Wcześniejsze prace nad naturą mechanizmu kinazy białkowej sugerują, że następuje ona w stanie przejścia dysocjacyjnego. Bisubstratowy analog został zaprojektowany przeciwko kinazie receptora insulinowego, aby naśladować geometrię odległości współrzędnych reakcji dysocjacyjnego stanu przejściowego. Ten bisubstratowy związek okazał się silnym inhibitorem wobec kinazy receptora insulinowego i zajmował zarówno miejsca wiązania peptydów, jak i nukleotydów. Związki bisubstratowe ze zmienionym potencjałem wiązania wodorowego, jak również różne odstępy między adeniną a peptydem, pokazują znaczenie oryginalnych cech konstrukcyjnych. Wykazaliśmy również, że pokrewne analogi bisubstratów mogą być stosowane do silnego blokowania kinaz serynowych / treoninowych, w tym kinazy białkowej A. Ponieważ wiele kinaz białkowych rozpoznaje złożone substraty białkowe dla skutecznej fosforylacji, korzystne było włączenie koniugatów PEPTYDOWO-ATP do struktur białkowych. Stosując ekspresję ligacji białek, wytworzono koniugat Src-ATP i wykazano, że jest ligandem o wysokim powinowactwie do kinazy tyrozynowej CSK. Niehydrolizowalna mimika fosfozera / fosfotyru może być przydatna w badaniu funkcjonalności zdarzeń fosforylacji. Wykorzystując ligację białek wyrażonych, zastosowaliśmy fosfonometyleno-fenyloalaninę i fosfonometyleno-alaninę do badania fosforylacji odpowiednio Tyr i Ser. Narzędzia te pozwoliły na analizę fosfataz SH2 (SHP1 i SHP2), ujawniając nową wewnątrzcząsteczkową stymulację aktywności katalitycznej za pośrednictwem odpowiednich zdarzeń fosforylacji. Zostały one również wykorzystane do scharakteryzowania komórkowej regulacji enzymu rytmu melatoniny przez fosforylację.