materiały i metody
Duplex przygotowanie DNA. W celu wytworzenia 30-bp dupleksowych cząsteczek DNA, hybrydyzowano dwa oligonukleotydy o następującej sekwencji i modyfikacjach (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotyd 5′-GGGTATGGAGATTTTAGCGGAGTGACAGC-3′ oznaczono Cy5 na jego 5′ końcu i Cy3 na jego 3 ’ końcu. Komplementarny oligonukleotyd znakowano biotyną na obu końcach.
Ekspresja i oczyszczanie białka. Gen żółtego fluorescencyjnego białka (YFP) w plazmidzie P2bac/pFastBac-yfp-M5-CaM (prezent od H. Lee Sweeney, University of Pennsylvania, Filadelfia) został usunięty przez PCR. Otrzymany kod plazmidu p2bac / pFastBac-M5-CaM dla kurcząt myosin V, który jest obcięty w Glu-1099. Zamek błyskawiczny leucyny podążał za natywną zwiniętą cewką, aby zapewnić dimeryzację. Aby ułatwić oczyszczanie, białko miozyny V zostało N-terminalnie oznaczone znacznikiem znacznika (DYKDDDDK). Dwa rekombinowane bakulowirusy wytworzono do ekspresji białka w komórkach Sf9. Jeden kodował ściętą miozynę V i kalmodulinę Drosophila melanogaster pochodzącą z plazmidu P2bac / pFastBac-M5-CaM. Drugi wirus kodował ludzki niezbędny łańcuch lekki pochodzący z plazmidu p2bac / pFastBac-ELC. Oba wirusy zostały użyte do koinfekcji komórek Sf9. Białko zostało wyrażone i oczyszczone zgodnie z opisem Sweeney i wsp. (20).
etykietowanie i wymiana Kalmoduliny. Kalmodulinę eksprymowano i znakowano Cy3 lub Cy5 w następujący sposób: pojedynczą cysteinę wprowadzono do kalmoduliny jeżowca za pomocą mutacji Q143C. Kalmodulinę tę wyrażono w Escherichia coli i oczyszczono zgodnie z opisem w ref. 21. Kalmodulinę znakowano roztworami stockowymi Cy3-maleimidu lub cy5-maleimidu (Amersham Biosciences) (w DMSO) w 1,4-krotnym stosunku molowym przez 20 minut. Nadmiar barwnika usunięto przez przesączenie żelu do buforu wymiany (poniżej), a następnie przez noc absorpcję hydrofobową na Biobeady (Bio-Rad). Włączenie etykiety wynosiło 102% dla Cy3-kalmoduliny i 75% dla Cy5-kalmoduliny. Alikwoty przechowywano w temperaturze -80°C.
wymianę znakowanej kalmoduliny na miozynę V przeprowadzono zgodnie z opisem, ale z pewnymi modyfikacjami (22). Myosynę V (150 nM) inkubowano z kalmoduliną znakowaną Cy3 o długości 0,7 nM i kalmoduliną znakowaną Cy5 o długości 0,8 nM w buforze wymiany (25 mM KCl/20 mM imidazol HCl, pH 7,4 / 2 mM MgCl2 / 1 mm EGTA) w temperaturze 22°C przez 2 minuty. W celu wymiany kalmodulin dodano 0,9 mM CaCl2 i mieszaninę inkubowano w temperaturze 22°C przez 5 minut. Reakcję hartowano za pomocą 7 mM EGTA. Mieszaninę reakcyjną naniesiono na urządzenie do ultrafiltracji Nanocep o mocy 100 K MWCO (Pall) i przemyto trzykrotnie równą objętością AB (poniżej) w celu oczyszczenia miozyny V z nadmiaru kalmoduliny.
Przygotowanie Komórek Przepływowych. Komórka przepływowa została zbudowana ze szklanego szkiełka mikroskopowego i wysoce załamujących się klipsów wykonanych z NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA) połączonych kawałkami dwustronnej taśmy klejącej.
w przypadku eksperymentów z miozyną V inkubowano 15 µl biotyny-BSA (1 mg·ml-1) w komórce przepływowej przez 2 minuty, po czym 30 µl buforu AB (25 mM KCl/25 mM imidazolowego HCl, pH 7,4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) przepuszczono przez komorę przepływową, aby ją wypłukać. Do komórki dodano piętnaście mikrolitrów 0,5 mg/ml Neutrawidiny (sond Molekularnych) i pozostawiono do inkubacji przez 2 minuty, po czym przeprowadzono kolejne płukanie buforem AB. Komórkę przepływową inkubowano z 15 µl biotynylowanych włókien falloidynowych aktyny (250 nM) przez 5 minut, a następnie przemyto 100 µl buforem AB. Wreszcie, komórkę załadowano 20 µl buforu obrazującego, w tym wymienianą kalmoduliną miozynę V, 5 µM kalmoduliny, 300 nM ATP, system regeneracji ATP (0,1 mg·ml-1 fosfokinaza kreatynowa/1 mM fosforan kreatyny) i 0,5% (obj./obj.) Triton-X 100 w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania. Ogniwo zostało uszczelnione smarem próżniowym i natychmiast zobrazowane. Końcowe stężenie motoryczne spowodowało słabo dekorowaną aktynę, co pozwoliło na analizę pojedynczych cząsteczek miozyny V.
w przypadku eksperymentów DNA biotyna-BSA i Neutrawidina były ładowane w taki sam sposób, jak w przypadku eksperymentów miozyny V, ale płukania przeprowadzono buforem T50 (10 mM Tris, pH 8,0/50 mM NaCl). Gdy komórka przepływowa miała powłokę NeutrAvidin, 15 µlof dsDNA (30 nM) w buforze T50 z 1 mg·ml-1 BSA przepłynęło i inkubowano przez 2 minuty, po czym przepłynęło 100 µl buforu obrazującego. Komórka przepływowa została następnie uszczelniona smarem próżniowym i natychmiast zobrazowana. Otrzymana Dekoracja cząsteczek DNA na powierzchni była na tyle rzadka, że fluorescencyjne plamy z różnych cząsteczek rzadko nakładały się na siebie.
Mikroskop Total internal reflection fluorescence (TIRF)został skonfigurowany zgodnie z opisem w ref. 8, z pewnymi modyfikacjami (rys. 5, która jest publikowana jako informacja uzupełniająca na stronie internetowej PNAS). Wiązki źródeł wzbudzenia przy 532 nm (Coherent, Santa Clara, CA) i 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) zostały połączone przez lustro dichroiczne i rozszerzone do średnicy 7 mm. Źródła te były skupione (ogniskowa = 500 mm) na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu Olympus 1,65 NA ×100 TIRF za pomocą dichroicznej linii laserowej na etapie translacji liniowej, która umożliwia pracę mikroskopu w trybie epifluorescencji lub TIRF. Obiekt umieszczony był w zamkniętej pętli, dwuosiowej, piezoelektrycznej stacji nanotranslacyjnej wyposażonej w pojemnościowe czujniki do pomiaru położenia (Physik Instrumente, Auburn, MA). Światło odbite wychodzące z tylnej apertury obiektywu zostało skierowane na kwadrantową fotodiodę, aby zapewnić sygnał dla pętli sprzężenia zwrotnego ostrości, która zaciskała odległość między obiektywem a próbką za pomocą siłownika elektrostrycznego (Newport, Fountain Valley, CA). Emisja fluorescencji została zebrana przez obiektyw, przepuszczona przez dwa cienkowarstwowe filtry stopline (Semrock, Rochester, NY), po jednym dla każdego źródła wzbudzenia i przekazana przez aparat o podwójnym widoku, który umożliwiał jednoczesne obrazowanie kanałów Cy3 i Cy5 na pojedynczej kamerze IXON DV 887 EMCCD (Andor Technology, Belfast, Irlandia). Wszystkie dane zostały zobrazowane z czasem integracji 0,5 sek. Przesłuchy między dwoma kanałami (10%) prawdopodobnie odkształcają pomiary odległości w kierunku mniejszych wartości. Nasz eksperymentalny błąd, jakkolwiek, czyni go niewykrywalnym, jak pokazywał Monte Carlo symulacje w którym 100 pary modelować wizerunki pojedynczy fluorophores oddzielający 10 nm tworzyć i analizować identycznie jak z DNA DANE (opisujący niżej). Symulowane obrazy funkcji rozproszenia punktów fluorescencyjnych obliczono poprzez wygenerowanie zintegrowanego rozkładu intensywności Gaussa 2D ze stałym tłem, do którego dodano szum. Symulowane piki miały takie same wymiary i stosunek sygnału do szumu jak rzeczywiste piki. Symulowane dane z 10% przesłuchem i symulowane dane bez przesłuchu są nie do odróżnienia w teście Kołmogorowa-Smirnowa (N 1 = 100, N 2 = 100, p > 0,05).
Analiza Danych. Mapowanie rejestracyjne kanałów Cy3 i Cy5 przeprowadzono za pomocą fiducjałów składających się z kulek Transfluosfery o długości 100 nm (sond molekularnych). Były wzbudzone przy 532 nm i emitowały z szerokim spektrum emisyjnym. Koralik był wykrywalny w obu naszych kanałach. Zlokalizowaliśmy pojedynczy koralik związany z coverslipem, a za pomocą naszego etapu piezoelektrycznego podeptaliśmy go z nanometrową precyzją w wzór siatki (z odstępem 0,5 µm), robiąc zdjęcie na każdym przystanku. Efektem końcowym był stos 312 obrazów, które pokazują koralik w obu kanałach w różnych pozycjach (rys. 1a).
dane DNA były analizowane przez domowe oprogramowanie przy użyciu matlab (Mathworks, Natick, MA). Procedura automatycznie lokalizuje piki w obrazie, określając piksele o wysokiej intensywności i zapewnia, że otaczające piksele mają intensywność zgodnie z oczekiwaniami dla pojedynczego fluoroforu. Przed dopasowaniem pików do funkcji Gaussa 2D, aby uzyskać jej centralne położenie, szukamy par pików. Piksele znajdujące się w kanale Cy5 są mapowane na kanał Cy3 i przeprowadza się wyszukiwanie pików w otaczających pikselach Cy3. Jeśli pik zostanie znaleziony, pik Cy5 i pik Cy3 są uważane za parę do dalszej analizy. Każdy pik jest dopasowany do funkcji Gaussa 2D w odpowiedniej przestrzeni, jak opisano dla koralików powyżej (Eq. 1 ). Błąd w średniej lokalizacji dopasowania jest obliczany na podstawie liczby zebranych fotonów (Ny), 
lokalizacja Cy5 jest odwzorowana na kanał Cy3, a odległość między nimi jest obliczana. Po analizie obliczeniowej danych DNA, zidentyfikowane pary fluorophore przesiewano ręcznie, aby upewnić się, że pary nie były zbliżone do innych fluorophores, które przeszkadzały w analizie par.
dane miozyny V analizowano, najpierw identyfikując ruchomy silnik okiem. Domowe oprogramowanie napisane w matlab dopasowało wyjściową parę fluorescencyjnych pików do funkcji Gaussa 2D, jak opisano powyżej i kontynuowało śledzenie pików tak długo, jak określono przez użytkownika. Analizowano silniki, których skoniugowane barwniki każdego fotobluszczu w jednym kroku, podobnie jak w przypadku większości obserwowanych silników, co zapewniło, że rzeczywiście badaliśmy silniki z tylko jedną etykietą Cy3 i jedną etykietą Cy5. Uzyskane trajektorie zarejestrowano poprzez odwzorowanie trajektorii Cy5 na kanał Cy3. Najmniejsze kwadratowe dopasowanie liniowe do punktów z obu trajektorii dało orientację żarnika aktynowego, do którego rzutowano trajektorie. Odległości wzdłuż dopasowania liniowego (żarnik aktyny) zostały wykreślone w czasie, aby zobaczyć względne odległości głowic (rys. 4).
ślad czasowy różnie znakowanej cząsteczki miozyny V idącej wzdłuż włókna aktyny. Etykiety (Cy3 i Cy5)są kowalencyjnie przyłączone do kalmodulin, które zostały wymienione na cząsteczkę miozyny V. W tym śledzeniu obie lokalizacje sondy fluorescencyjnej wykonują kroki 72 nm, co wskazuje, że kalmoduliny były wymieniane w pobliżu domeny motorycznej. Naprzemienne pozycje sond zapewniają bezpośrednią obserwację mechanizmu chodzenia ręcznego myosin V.