kluczowe znaczenie ma Kontrola miana wirusa w badaniach eksperymentalnych z wirusami. Aby ułatwić porównywanie badań przeprowadzonych w różnych laboratoriach, pożądane jest stosowanie zharmonizowanych metod standardowych. W przypadku ludzkiego herpeswirusa 6 (HHV-6) , β-herpeswirusa , na który większość ludzi była narażona, do oceny miana wirusa często stosuje się metodę 50% tissue culture infectivity dose (TCID50). Powszechnie stosowanym odczytem jest oczna Kontrola efektów cytopatycznych (CPE), czyli powiększenia zainfekowanych komórek . Jedną z przeszkód w tym podejściu jest to, że komórki mogą się powiększać nawet wtedy, gdy nie są zainfekowane. Jest to szczególnie trudne na granicy infekcji w serii miareczkowania, ponieważ komórki powiększone z powodu infekcji mają tendencję do mniejszego powiększania się przy zwiększonym rozcieńczeniu wirusa( dodatkowy plik 1: Rysunek S1). Test immunofluorescencyjny (IFA) jest alternatywnym podejściem odczytu do kontroli ocznej w ocenie TCID50 lub do obliczania jednostek zakaźnych, tj. frakcji zakażonych komórek . Odczyt oparty na IFA jest bardziej wyraźny w rozróżnianiu zainfekowanych od niezakażonych komórek, ale barwienie jest pracochłonne i znaczna liczba komórek musi być policzona, aby uzyskać wiarygodne wartości. Monitorowanie poszczególnych komórek wiąże się z ryzykiem błędnej interpretacji pozytywności komórki, co jest wadą zarówno kontroli ocznej, jak i odczytów opartych na IFA. Dlatego opracowaliśmy i zwalidowaliśmy alternatywne podejście odczytu TCID50, w którym wzrost miareczkowania DNA wirusa jest mierzony w każdej studzience miareczkowania płytek hodowli TCID50 przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (Q-PCR). Podejście to porównano z badaniem ocznym i odczytem IFA TCID50 oraz z opisanym powyżej podejściem dotyczącym jednostek zakaźnych.
HHV-6A (szczep GS) propagowano w linii limfocytów T HSB – 2 w glutamaxie zawierającym pożywkę RPMI 1640 (Invitrogen, Wielka Brytania) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (HyClone, UT), 100 J./ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny (Invitrogen). Gdy około 50% żywych komórek powiększyło się, supernatant zebrano i zamrożono natychmiast w podlicznikach w temperaturze -80°C do czasu analizy. Jako środki kontrolne, supernatant wirusa z przejścia 17 (P17) inaktywowano światłem UV przez 20 minut lub poddano obróbce cieplnej w temperaturze 56°C przez 1 godzinę. Replikację HHV-6A w komórkach HSB – 2 obserwowano przez dziesięć dni przy użyciu Q-PCR (Applied Biosystems, Wielka Brytania), jak opisano wcześniej . Przed analizą Q-PCR DNA ekstrahowano z zawiesin komórkowych za pomocą 96-studzienkowego zestawu koralików płytkowych zgodnie z protokołem producenta (MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit, Applied Biosystems). W celu oceny zawartości DNA HHV-6A w partiach wirusa, Q-PCR przeprowadzono w sposób opisany powyżej po ekstrakcji DNA z użyciem kolumn filtracyjnych (QIAGEN GmbH, Niemcy).
w celu utworzenia płytek hodowli TCID50, zawiesiny komórek 40 µl 104 komórek HSB-2 na studzienkę zaszczepiono w 96-studzienkowych płytkach hodowli o okrągłym dnie. Komórki zaszczepiono przez 3-4 godziny 160 µl pięciokrotnego rozcieńczenia supernatantu HHV-6A, sześć replikatów na rozcieńczenie. Makiety i średnie elementy sterujące znajdowały się w studzienkach trójdzielnych na wszystkich płytach. Komórki przemyto raz, a następnie pobrano 50-70 µl zawiesiny komórkowej z każdej studzienki i przechowywano w temperaturze -80°C jako próbki zero day post infection (DPI). Pozostałe zawiesiny komórkowe inkubowano przez siedem dni w temperaturze 37°C. Przy siedmiu dpi rozmrożona płytka zero dpi i siedem płyt dpi poddano ekstrakcji DNA przy użyciu zestawu opartego na koralikach opisanego powyżej. Następnie DNA wirusa oznaczano ilościowo za pomocą Q-PCR, jak opisano powyżej.
dla IFA komórki przymocowano do szkiełek mieszaniną acetonu i metanolu w stosunku 1:1 w temperaturze -20°C przez 10 minut, Zablokowano 5% surowicy koziej i 3% BSA w PBS i zabarwiono pierwotnym mysim przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla glikoproteiny HHV-6 gp116/54/64 (Advanced Biotechnologies, MD). Barwienie wizualizowano za pomocą skoniugowanego koziego antygenu IgG (Invitrogen) Alexa 633. Do wizualizacji jąder komórkowych wykorzystano barwienie 4′,6-diamidino-2-fenylindolem (Vector laboratories, CA). Prowadnice pokrywy montowano za pomocą nośników montażowych (DAKO A / S, dania), a prowadnice analizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego (Leica Microsystems, Niemcy). Frakcję zakażonych komórek oznaczano metodą ręcznego liczenia. Jeśli ≥1/3 komórek zawierało białko wirusowe, zliczano ≥25 komórek na studzienkę i jeśli <1/3 komórek zawierało białko wirusowe, zliczano ≥100 komórek na studzienkę. Studzienki, w których ≥2% komórek zabarwionych dodatnio uznano za zakażone. Poziom wzrostu obciążenia wirusowego DNA w każdej odwiercie był skorelowany z barwieniem IFA konstruując wzór w programie Excel (Microsoft, WA). Ten wzór pyta, czy DNA wirusa w pewnej studni w płytce TCID50 przesunęło się określoną liczbę razy i czy ta sama studnia była dodatnia w IFA, czy nie.
w celu porównania z odczytem Q-PCR, wszystkie płytki TCID50 zostały ocenione za pomocą mikroskopu kontrastowego fazowego przez dwóch niezależnych inspektorów (ocular TCID50). Studnie uznano za zakażone, jeśli znaleziono co najmniej jedną powiększoną komórkę. Dla obu podejść odczytu TCID50 obliczono według wzoru Reeda i Muencha .
wyniki TCID50 określone przez Q-PCR (Q-PCR TCID50) porównano z oceną jednostek zakaźnych przeprowadzoną przez IFA (personal communication with Louis Flamand) w trzech punktach czasowych dla P19 i jednym dla P27. Krótko mówiąc, 2,5 * 105 komórek HSB-2 zaszczepiono, jak opisano powyżej, różnymi rozcieńczeniami wirusa w trzykrotnych studzienkach dla każdego rozcieńczenia. W dwóch dpi komórki poddano IFA ukierunkowanemu na wczesne białko wirusowe p41 (klon 9a5d12, Santa Cruz Biotech. Inc., CA) jak opisano powyżej. Miano wirusa, wyrażone jako jednostki zakaźne na ml, obliczono przez pomnożenie frakcji zakażonych komórek przez całkowitą liczbę komórek przy zerowym dpi i współczynnikach rozcieńczenia.
w celu określenia optymalnego punktu czasowego dla pomiarów wzrostu obciążenia DNA wirusa, replikację wirusa obserwowano przez dziesięć dni. Do osiągnięcia wystarczającego wzrostu DNA wirusa potrzeba było siedmiu dni (ryc. 1) i dlatego wybrano go jako punkt czasowy zbiorów. Aby ustalić punkt cięcia względnego wzrostu DNA wirusa odpowiadającego dodatniemu zakażeniu, wzrost obciążenia DNA wirusa korelowano z ekspresją białka wirusa. IFA przeprowadzono w siedmiu dpi na komórkach z każdej studni w trzech płytkach TCID50 dla dwóch różnych partii wirusa. Optymalnym punktem cięcia okazał się dziesięciokrotny wzrost wirusowego DNA, gdzie korelację z ekspresją białka zaobserwowano w 93% studzienek (rycina 2).
replikacja HHV-6A (szczep GS), a następnie Q-PCR. Przedstawione dane są średnimi wynikami (± SEM) hodowli w trzech egzemplarzach dla każdej wielokrotności zakażenia (MOI). Linie łączące przerywają się, gdy obciążenie DNA wirusa spadnie poniżej granicy wykrywalności.
określenie punktu przecięcia dla infekcji. Optymalnym punktem cięcia dla zakażenia był dziesięciokrotny wzrost, w którym korelacja z ekspresją białka była obserwowana w 93% studzienek przez IFA z przeciwciałem skierowanym na późne białko wirusa gp116 / 54 / 64. Brak dobrze zawartego białka wirusowego, w którym obciążenie DNA wirusa nie wzrosło dziesięciokrotnie. Przedstawione dane są średnimi wynikami (± SEM) z trzech płytek TCID50.
porównując wartości Q-PCR TCID50 do IFA TCID50, jeden Q-PCR TCID50 wynosił odpowiednio 1,41 i 1,03 IFA TCID50 na podstawie 13 lub 5 ocen. Q-PCR TCID50 nie dawało statystycznie różnych wartości w porównaniu do TCID50 ocznego lub IFA (odpowiednio p = 0,41 lub p = 0,29) (sparowany test t) (Tabela 1).
wirusowe numery kopii DNA są często używane jako przybliżone oszacowanie ilości cząstek wirusa, które zawiera dana partia wirusa. Nie jest jednak pewne, jak dobrze odpowiada to zakaźności. Aby to ocenić, wartości TCID50 porównano z numerami kopii DNA wirusa dla danej partii. Średnie współczynniki obciążenia DNA wirusa Q-PCR TCID50 w partiach wirusa były podobne dla P17 i P19; odpowiednio 6,3*105 i 2,0*106 kopii DNA wirusa na TCID50. Jednak dla P21 stosunek ten był znacznie wyższy, 1,3 * 108 kopii DNA wirusa na TCID50 (Tabela 1). Tak więc, pomiar DNA wirusa w supernatantach partii jest niewystarczający do prawidłowego przypisania zakaźności partii i dlatego należy przeprowadzić testy biologiczne w celu dokładnego określenia miana wirusa.
średni wewnętrzny współczynnik zmienności (CV) dla Q-PCR TCID50 wynosił 9%, oznaczany przez równoległe duplikaty ekstrakcji i Q-PCR z trzech płytek hodowli TCID50. Dla TCID50 ocznego wartość CV wewnątrz testu wynosiła 45%, oznaczona na podstawie łącznie dwunastu płytek hodowli TCID50 odczytanych przez dwóch niezależnych asesorów. CV wewnątrz testu wynosiło 14% dla IFA TCID50 oznaczonego przez dwa równoległe barwienie komórek z dwóch serii. Dla jednostek zakaźnych zbliżonych do wewnątrz testu CV oznaczono 43% na podstawie czterech równoległych barwień komórek z jednego cyklu. Średni między teście CV wynosił 73% dla Q-PCR TCID50 i 66% dla TCID50 ocznego, oznaczony dla trzech partii wirusa, odpowiednio pięć, trzy i trzy razy. Dla IFA TCID50 MIĘDZYTESTANOWY CV wynosił 25%, oznaczany dla jednej serii trzy razy. Dla jednostek zakaźnych zbliżonych do testu CV wynosiło 77%, oznaczonych w trzech oddzielnych seriach dla jednej partii.
podsumowując, opisana tutaj metoda Q-PCR TCID50 dobrze koreluje z ekspresją białek wirusowych, a tym samym ma wysoką swoistość dla dawki zakaźnej. Jest bardziej wytrzymały niż TCID50 oczny, IFA TCID50 i podejście jednostek zakaźnych, w oparciu o wartości CV wewnątrz testu. Intra-assay CV jest w tym zestawieniu miarą tego, jak dokładne jest pewne podejście odczytu, a zatem jest najbardziej dokładną wartością dla porównania różnych metod. Aby dostosować metodę, punkt cięcia musi być określony dla każdego testowanego szczepu wirusa i każdej użytej linii komórkowej. Podejście odczytu Q-PCR jest bardziej pracochłonne niż kontrola oczna, ale naszym zdaniem znacznie mniej pracochłonne niż IFA TCID50 i podejście jednostek zakaźnych. Jest droższy pod względem zasobów laboratoryjnych niż kontrola oczna, IFA TCID50 i podejście jednostek zakaźnych. Jednak nasze dane podkreślają znaczenie wykonywania testów biologicznych w celu dokładnego określenia miana wirusa, co może uzasadniać koszty i robociznę. Ponadto lepsza standaryzacja metod oceny miana wirusa stosowanych w dziedzinie HHV-6 może zwiększyć zgodność między różnymi badaniami.