A colocalização de moléculas simples de alta resolução de Cy3 e Cy5 ligadas a macromoléculas mede distâncias intramoleculares ao longo do tempo

materiais e métodos

Duplex preparação de ADN. Para fazer as moléculas de DNA duplex de 30-bp, dois oligonucleotídeos com a seguinte sequência e modificações foram hibridizados (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). O oligonucleótido 5′ – GGGTATGAGATTTAGCGAGTGACAGC-3 ‘foi rotulado com Cy5 no seu fim de 5′ e Cy3 no seu fim de 3’. O oligonucleótido complementar foi rotulado com biotina em ambas as extremidades.Expressão proteica e purificação . O gene amarelo fluorescente (YFP) no plasmídeo p2Bac/pFastBac-YFP-M5-CaM (um presente de H. Lee Sweeney, Universidade da Pensilvânia, Filadélfia) foi deletado pela PCR. Os códigos p2Bac/pFastBac-M5-CaM plasmídeos resultantes para a miosina V de frango truncada a Glu-1099. Um fecho de leucina seguiu a bobina nativa enrolada para garantir a dimerização. Para facilitar a purificação, a proteína miosina V foi marcada terminalmente com uma etiqueta de bandeira (DYKDDDK). Dois baculovírus recombinantes foram gerados para a expressão proteica em células Sf9. Um codificou a miosina V truncada e a calmodulina Drosophila melanogaster derivada do plasmídeo p2Bac/pFastBac-M5-CaM. O segundo vírus codificou a cadeia de luz humana essencial derivada do plasmídeo p2Bac/pFastBac-ELC. Ambos os vírus foram utilizados para a co-infecção de células Sf9. A proteína foi expressa e purificada conforme descrito por Sweeney et al. (20).

Calmodulin Labeling and Exchange. A calmodulina foi expressa e rotulada com Cy3 ou Cy5 da seguinte forma: uma única cisteína foi introduzida na calmodulina do ouriço-do-mar através da mutação Q143C. Esta calmodulina foi expressa em Escherichia coli e purificada tal como descrito em ref. 21. A calmodulina foi rotulada com soluções de estoque Cy3-maleimida ou Cy5-maleimida (Biosciências Amersham) (em DMSO) a uma razão molar de 1,4 vezes por 20 minutos. O excesso de corante foi removido por filtração em gel em tampão de troca (abaixo), seguido de absorção hidrofóbica durante a noite em BioBeads (Bio-Rad). A incorporação no rótulo foi de 102% para Cy3-calmodulina e 75% para Cy5-calmodulina. As alíquotas foram armazenadas a -80 ° C.

a troca de calmodulina rotulada para a miosina V foi realizada como descrito, mas com algumas modificações (22). A miosina V (150 nM) foi incubada com calmodulina marcada com 0,7 nM Cy3 e calmodulina marcada com 0,8 nM Cy5 em tampão de permuta (25 mM KCl/20 mM imidazole HCl, pH 7,4/2 mM MgCl2/1 mM EGTA) a 22°C durante 2 minutos. Para trocar calmodulinas, adicionou-se CaCl2 de 0,9 mM e incubou-se a mistura a 22°C durante 5 minutos. A reacção foi apagada com EGTA de 7 mM. A mistura de reacção foi aplicada num dispositivo de ultrafiltração Nanocep de 100K MWCO (Pall) e lavada três vezes com volumes iguais de AB (abaixo) para purificar a miosina V do excesso de calmodulina.

Preparação De Células De Fluxo. A célula de fluxo foi construída com uma lâmina de microscópio de vidro e tampas de alta refração feitas de NLAF21 (VA Optical Labs, San Anselmo, CA), unidas por peças de fita adesiva escocesa de dois lados.

Para a miosina V experimentos, 15 µl de biotina-BSA (1 mg·ml-1) foi incubado na célula de fluxo por 2 min, depois do qual 30 µl de AB buffer (25 mM de KCl/25 mM de imidazole HCl, pH 7.4/1 mM EGTA/4 mM MgCl2/10 mM DTT/1 mg·ml-1 BSA) foi aprovada através da célula de fluxo para o lavar. Quinze microlitros de 0, 5 mg/ml de Neutravidina (sondas moleculares) foram adicionados à célula e foi-lhe permitido incubar durante 2 minutos, após o que foi feita outra lavagem com tampão AB. Incubou-se a célula de escoamento com 15 µl de filamentos de actina faloidina biotinilada (250 nM) durante 5 minutos, seguida de uma lavagem de 100 µl com tampão AB. Finalmente, a célula foi carregado com 20 µl de buffer de imagem, incluindo calmodulin-trocaram de miosina V, 5 µM calmodulin, 300 nM ATP ATP regeneração do sistema (0,1 mg·ml-1 de creatinafosfoquinase/1 mM de fosfato de creatina), e 0,5% (vol/vol) de Triton-X 100 para reduzir a ligação não específica. A célula foi selada com graxa de vácuo e imediatamente fotografada. A concentração final do motor resultou em actina pouco decorada e, assim, permitiu uma análise de moléculas de miosina V únicas.

para os experimentos de DNA, a biotina-BSA e a Neutravidina foram carregadas da mesma forma que para os experimentos de miosina V, mas as lavagens foram feitas com tampão T50 (Tris 10 mM, pH 8,0/50 mM NaCl). Uma vez que a célula de fluxo tinha um revestimento de Neutravidina, foram introduzidos e incubados durante 2 minutos 15 µlof dsDNA (30 nM) em tampão T50 com 1 mg·ml-1 BSA, após o que foram lançados 100 µl de tampão de imagem. A célula de fluxo foi então selada com graxa de vácuo e imediatamente fotografada. A decoração resultante de moléculas de DNA na superfície era suficientemente escassa que manchas fluorescentes de diferentes moléculas raramente se sobrepunham.

Configuração Do Microscópio. O microscópio de fluorescência da reflexão interna total (TIRF) foi criado conforme descrito na ref. 8, com algumas modificações (Fig. 5, que é publicado como informação de apoio no site PNAS). Feixes fonte de excitação a 532 nm (coerente, Santa Clara, CA) e 633 nm (JDS Uniphase, San Jose, CA) foram combinados por um espelho dicróico e expandidos para um diâmetro de 7 mm. Estas fontes foram focadas (distância focal = 500 mm) no plano focal traseiro de um objectivo do Olimpo 1,65 na ×100 TIRF por meio de uma linha de laser dicroica em um estágio de tradução linear que permite a operação de microscópio em ambos os modos de epifluorescência ou TIRF. O objetivo foi posicionado sob um ciclo fechado, de dois eixos, estágio de nanotranslação piezoeléctrico equipado com sensores capacitivos para medição de posição (Physik Instrumente, Auburn, MA). A luz refletida saindo da abertura traseira do objetivo foi direcionada em um fotodíodo do quadrante para fornecer um sinal para um loop de feedback focal que apertou a distância entre o objetivo e a amostra com um atuador eletrostritivo (Newport, Fountain Valley, CA). Fluorescência de emissão foram coletados por objetivo, passou por dois StopLine filmes finos notch filters (Semrock, Rochester, NY), um para cada fonte de excitação, e transmitido através de um duplo-vista aparelho que permitia simultânea de imagem do Cy3 e Cy5 canais em um único iXon DV 887 EMCCD câmara (Andor Tecnologia, Belfast, Irlanda). Todos os dados foram fotografados com um tempo de integração de 0,5 segundos. Crosstalk entre os dois canais (10%) presumivelmente distorce as medições de distância para valores menores. Nosso erro experimental, no entanto, torna-o indetectável, Como mostrado por simulações de Monte Carlo em que 100 pares de imagens modeladas de fluoróforos individuais separados por 10 nm foram criados e analisados de forma idêntica aos dados de DNA (descritos abaixo). Imagens simuladas de funções de propagação de pontos fluorescentes foram calculadas gerando uma distribuição integrada de intensidade gaussiana 2D com um fundo constante ao qual o ruído de disparo foi adicionado. Os picos simulados tinham as mesmas dimensões e Relação sinal-ruído que os picos reais. Dados simulados com 10% de crosstalk e dados simulados sem crosstalk são indistinguíveis por um teste de Kolmogorov-Smirnov (N 1 = 100, n 2 = 100, p > 0,05).

Data Analysis. Um mapeamento de registro dos canais Cy3 e Cy5 foi realizado com fiduciais consistindo de contas Transfluóricas de 100 nm (sondas moleculares). Eles estavam excitados a 532 nm, e emitem com um amplo espectro de emissão. A conta foi detectável em ambos os canais. Nós localizamos uma única conta associada ao coverslip, e com o nosso estágio piezoeléctrico a pisamos com precisão nanométrica em um padrão de grade (com um espaçamento de 0,5 µm), tomando uma imagem em cada parada. O resultado final foi uma pilha de 312 imagens que mostra a conta em ambos os canais em diferentes posições(Fig. 1a).