afinidade da hemoglobina para o oxigénio em três subespécies de sapos (Bufo sp.) que vivem em diferentes altitudes
HRVOJ OSTOJIC1, CARLOS MONGE-C2, VERONICA CIFUENTES3
1 Clinicum Laboratório Automatizado, Iquique, Chile
2 Laboratório de Transporte de Oxígeno, Universidad Peruana Cayetano Heredia, em Lima, Peru
3 Universidade Arturo Prat, Iquique, Chile
RESUMO
de oxigênio no Sangue de afinidade e de células vermelhas do sangue propriedades foram medidos em três subespécies do gênero Bufo: Bufo spinulosus limensis, recolhidos ao nível do mar e em um dia médio de temperatura de 20ºC; Bufo spinulosus trifolium, a partir de 3100 m, temperatura média do dia de 15ºC; e Bufo spinulosus flavolineatus, a partir de 4100 m, temperatura média do dia de 10ºC. A eletroforese da hemoglobina mostrou o mesmo componente em cada uma das três subespécies. A 20ºC, as afinidades de oxigénio no sangue (P50) mostraram pequenas diferenças entre o Bufo spinulosus limensis e o Bufo spinulosus trifolium, enquanto o valor para o Bufo spinulosus flavolineatus era nitidamente inferior. A 10ºC, a temperatura ambiente de Bufo spinulosus flavolineatus, o P50 foi extremamente baixa em comparação com as outras duas subespécies em suas temperaturas ambientes correspondentes.
PALAVRAS-CHAVE: adaptações, altitude, anfíbios, Bufo spinulosus limensis, Bufo spinulosus trifolium, Bufo spinulosus flavolineatus, afinidade da hemoglobina, hematocrits, ligação de oxigénio, sapos
INTRODUÇÃO
No Peru, o gênero Bufo ocupa um gradiente altitudinal variando desde o nível do mar até acima de 4000 m. A espécie Bufo spinulosus tem três subespécies cujos nichos estão em altitudes baixas, intermediárias e altas. Estas subespécies são Bufo spinulosus limensis (de baixa altitude), Bufo spinulosus trifolium (intermediário altitude) e Bufo spinulosus flavolineatus (altitude) (12). Uma das adaptações ambientais mais intensivamente estudadas do sistema respiratório em vertebrados é a da hipoxia, que ocorre variadamente em alta altitude, no desenvolvimento embrionário (por exemplo, in utero) e em ambientes aquáticos, particularmente água doce. Estas adaptações geralmente envolvem mudanças nas propriedades dos glóbulos vermelhos, na capacidade de transporte de oxigênio, ou na afinidade de oxigênio da hemoglobina. Intraespecífica adaptações que ocorrem no mesmo animal em diferentes condições, geralmente, envolvem mudanças na alostéricos fatores (por exemplo, as condições em que a hemoglobina funções dentro dos glóbulos vermelhos), enquanto que interespecíficos adaptações, que são evidentes quando se compara diferentes espécies, são atribuíveis a alterações nas propriedades das moléculas de hemoglobina.
a maioria dos estudos sobre adaptações hipóxicas em células vermelhas e propriedades da hemoglobina referem-se a peixes e mamíferos, e muito pouco se sabe sobre vertebrados ectotérmicos inferiores. Um estudo anterior mostrou que o sapo do Lago Titicaca Telmatobius culeus (2) que vivia a 3800 m. tinha maior afinidade de O2 no sangue e células sanguíneas menores do que as rãs do nível do mar. Este estudo descreve as adaptações na subespécie Bufo.
materiais e métodos
Anuranos da subespécie Bufo spinulosus limensis foram colhidos das planícies costeiras a cerca de 400 km do nosso laboratório em Lima (nível do mar, temperatura média diária de 20ºC). Bufo spinulosus trifolium foi coletado nos Andes peruanos centrais (cerca de 3100 m, temperatura média do dia 15ºC), e Bufo spinulosus flavolineatus também nos Andes centrais (a 4100 m, temperatura média do dia 10ºC). Os animais foram levados para o nosso laboratório em poucas horas. O sangue foi extraído em seringas heparinizadas dos corações de animais previamente picados. Podem obter-se aproximadamente 3 ml de sangue de Bufo spinulosus limensis e 1 a 1, 5 ml de outras subespécies. O sangue de dois a três animais foi agrupado para realizar as determinações. Contagens de glóbulos vermelhos, concentração de hemoglobina e hematócrito foram medidos por técnicas convencionais.
a electroforese da hemoglobina foi realizada em tiras de acetato de celulose em um tampão específico para a eletroforese da hemoglobina, e as bandas foram manchadas com Ponceau S e lidas em um densitômetro de acordo com o manual de instruções Helena Laboratories (USA).
a afinidade sangue-oxigénio (P50) foi medida pela técnica de mistura (1,10) a 10ºC, 15ºC e 20ºC. O equilíbrio sanguíneo foi realizado num tonómetro mantido a estas temperaturas utilizando misturas gasosas contendo 4,5% de CO2 e concentrações variáveis de O2 e N2. A saturação de O2 no sangue variou entre 30 e 80%. O medidor de pH foi calibrado usando tampões de fosfato de alta precisão.
Os valores de pH no temperaturas de equilíbrio (eq), foram calculadas a partir desses na medição de temperaturas (meas) usando a equação dada por Rosenthal (8):
pHeq = pH ponto de medição + 0.0147 (Teq _ Tmeas)
O fator de Bohr foi obtida alterando o pH do sangue como se segue. O Plasma Preparado a partir de alíquotas sanguíneas foi acidificado com ácido láctico ou alcalinizado com hidróxido de sódio e reconstituído com os correspondentes glóbulos vermelhos. As amostras de sangue de Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium foram equilibradas a 20º c e os 15 ° c e o sangue de Bufo spinulosus flavolineatus a 20º c e 10ºC e em diferentes valores de pH para calcular o fator de Bohr para cada temperatura (14). Este fator permitiu o cálculo do pH sanguíneo padrão nas três temperaturas. Para calcular o coeficiente do Monte (n), foi utilizado um método de aproximações sucessivas (10). Um valor da equação de Bohr para cada subespécie foi calculado a partir de dados em experimentos separados.
a equação de van’t Hoff foi utilizada para calcular o calor global da oxigenação DH’ a partir dos valores de P50. Para o Bufo spinulosus limensis, foram utilizados valores de 20ºC e 15ºC, tomando 20ºC como temperatura ambiente. Para o Bufo spinulosus trifolium, foram utilizados os valores a 15ºC e 20ºC, tomando 15ºC como temperatura ambiente. No caso do Bufo spinulosus flavolineatus, foram utilizados os valores a 10ºC e 20ºC, tomando 10ºC como temperatura ambiente. A significância estatística foi determinada pelo teste t do estudante com o software Systat 6.0 Para Windows.
resultados
tabelas i e II resumem os dados hematológicos. Não há diferença estatística entre os valores de Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium. Os valores do hematócrito, hemoglobina e a quantidade de RBC em Bufo spinulosus flavolineatus são muito mais baixos.
A eletroforese de experiências mostraram a mesma migração distâncias na hemoglobina de cada uma das três subespécies e a presença de duas bandas em algumas das pistas (Fig. 4). Não foram realizados mais estudos para definir as propriedades da hemoglobina.
Tabela II mostra as propriedades funcionais da hemoglobina no sangue, revelando pequenas diferenças no P50 entre Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium, considerando que o valor para o Bufo spinulosus flavolineatus é menor. Os valores à temperatura ambiente em que os animais foram recolhidos não diferiram significativamente entre Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium. No caso de Bufo spinulosus flavolineatus, a 10ºC o valor de P50 é muito baixo. A figura 1 mostra um gráfico de log P50 versus pH. A figura 2 mostra a dissociação do oxigênio da hemoglobina curvas construídas com os valores do P50 e do Morro do coeficiente de 20º C. As curvas de Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium são muito próximos uns dos outros, enquanto que para o Bufo spinulosus flavolineatus é deslocado para a esquerda. A figura 3 é um gráfico de conteúdo de O2 de Sangue contra PO2 de sangue à temperatura ambiente de cada subespécie. Isso mostra o baixo teor de O2 e de muito baixo P50 de Bufo spinulosus flavolineatus e moderado de deslocamento para a esquerda do Bufo spinulosus trifolium comparado ao Bufo spinulosus limensis sem redução de sangue teor de O2 no Bufo spinulosus limensis e Bufo spinulosus trifolium.
Fig. 1: efeito Bohr em três subespécies de Bufo spinulosus. Bufo spinulosus flavolineatus mostra o maior fator de Bohr.
Fig. 2: curva de Blooddissociações para as três subespécies a pH de 7,84 e 20 ° C. A curva do Bufo spinulosus flavolineatus é deslocada para a esquerda.
Fig. 3: teor de hemoglobina O2 vs pressão parcial de oxigénio para cada subespécie à respectiva temperatura ecológica. Bufo Spinulosus limensis (20º C), Bufo spinulosus trifolium (15º C)Bufo spinulosus flavolineatus (10º C). O teor de hemoglobina de Bufo spinulosus flavolineatus é menor do que nas outras duas subespécies e o P50 é muito baixo.
Fig. 4: electroforese das três subespécies de Bufo Spinulosus. O experimento mostra as mesmas distâncias de migração nas hemoglobinas de cada uma das três subespécies e a presença de duas bandas em algumas das corridas.
Estes resultados mostram que a 20º c Bufo spinulosus flavolineatus, cujo habitat natural é perto de 4000 m e cujo ambiente médias de temperatura de 10ºC, tem um baixo nível de hemoglobina de conteúdo e uma alta afinidade da hemoglobina, quando comparado ao Bufo spinulosus trifolium, cuja média temperatura ambiente altitude é de cerca de 3000 m e cujo ambiente com uma temperatura média de 15ºC. Bufo spinulosus limensis (nível do mar) e Bufo spinulosus trifolium tinham curvas quase idênticas. Se as curvas foram obtidas à temperatura ambiente, o Bufo spinulosus flavolineatus mostrou um conteúdo muito baixo de O2 e alta afinidade de hemoglobina em comparação com as outras duas subespécies. Em Bufo spinulosus flavolineatus, a alta DH’ indica uma alta sensibilidade da afinidade da hemoglobina para alterações na temperatura ambiente, e o alto fator de Bohr também indica uma alta sensibilidade da afinidade da hemoglobina para alterações no pH do sangue.
DISCUSSION
the genus Bufo is widespread in Andine countries. Bufo spinulosus tem três subespécies cujos nichos estão localizados nas encostas Andinas mais baixas, nos vales intermediários (3000 m) e nas planícies mais altas (acima de 4000 m). A subespécie de altitude intermédia Bufo spinulosus trifolium e a subespécie de nível do mar Bufo spinulosus limensis não diferem nos seus valores hematológicos. A alta altitude Bufo spinulosus flavolineatus tem uma concentração muito menor de hemoglobina, mas as características dos glóbulos vermelhos são semelhantes às outras duas subespécies. As RBC parecem ser menores que as das outras duas subespécies, ao contrário dos achados de Ruiz (9), que indicavam o contrário. É sabido que o gênero Bufo tem uma maior concentração de hemoglobina do que outros anfíbios. Hutchinson and Szarki (3) attribute this to the high vascularization and terrestrial habit. No entanto, Bufo spinulosus flavolineatus tem uma concentração muito baixa de hemoglobina.
nos três grupos, o estudo electroforético da hemoglobina mostra indivíduos cujo padrão eletroforético apresenta duas faixas claramente separadas de hemoglobina. Não há diferença na afinidade da hemoglobina entre Bufo spinulosus trifolium e Bufo spinulosus limensis a 20ºC, enquanto que no Bufo spinulosus flavolineatus é maior. Quando as afinidades foram estudados em temperaturas ambiente onde os animais vivem, Bufo spinulosus trifolium tinha curvas de dissociação do oxigênio que mudou moderadamente para a esquerda do Bufo spinulosus limensis, e Bufo spinulosus flavolineatus mostrou muito marcado shift, indicando uma alta afinidade da hemoglobina.
mamíferos e aves nativos de alta altitude tendem a ter afinidades de oxigênio no sangue elevado e não a mostrar policitemia em alta altitude (5). Seria interessante observar se estas respostas a hipoxia ambiente e condições de frio estão presentes em animais ectotérmicos. Em teoria, as condições de frio devem ajudar a aumentar a tolerância a alta altitude, porque diminui a taxa metabólica. No caso de Bufo spinulosus flavolineatus,cuja temperatura do dia sob pedras 4100 m é de cerca de 10ºC e cerca de 6ºC ou menos à noite, nas lagoas, onde eles descansam metade imerso, a alta afinidade indica pressão de seleção para a hipoxia, apesar de uma possível redução na taxa metabólica. Packard e Stiverson (7) não encontraram uma relação entre a altitude e a concentração de hemoglobina no Sapo coro (Pseudacris triseriata), mas o intervalo de altitude em seu estudo (1500 m e 3000 m) foi pequeno.
a afinidade da hemoglobina é uma marca genética aparentemente selecionada pelo ambiente hipóxico em vertebrados. Em mamíferos e aves a afinidade é uma propriedade bastante fixa que não aumenta a hipoxia e não desaparece na normóxia (6). Nos peixes, por outro lado, o oxigénio no sangue aumenta acentuadamente sob hipoxia (13). De um ponto de vista comparativo, existem algumas semelhanças entre os valores CE e os valores finais. Descobriu-se que existe alguma correlação entre a afinidade da hemoglobina e a altitude em subespécies de ratos que ocupam um gradiente altitudinal (11). Também foi demonstrado que dentro das mesmas espécies de mamíferos que vivem ao longo de um gradiente vertical nos Andes, os indivíduos que vivem na faixa mais alta têm hemoglobinas com maior afinidade do que os indivíduos que vivem na faixa mais baixa. Estas diferenças foram maiores no caso da raposa Andina, onde duas espécies separadas ocupam os dois extremos da faixa de altitude (4).
este trabalho reforça o conceito de que a policitemia não é selecionada como um parâmetro adaptativo ao ambiente hipóxico. Pelo contrário, a hemoglobina de alta afinidade parece ser fortemente selecionada em uma variedade de animais que vivem em alta altitude.
agradecimentos
agradecemos ao Dr. Roy E. Weber pela sua ajuda em clarificar o nosso pensamento sobre este assunto e por rever o manuscrito.
Autor Correspondente: Hrvoj Ostojic P.-Clinicum Laboratorio Automatizado, Casilla 169, Iquique, Chile. Telefone: (56-57) 420599, Fax: (56-57) 427683, e-mail: [email protected]
Received: August 13, 1999. Aceite na forma revista: 6 de Maio de 2000
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