distribuição de Poisson, em homenagem ao matemático francês Siméon Denis Poisson, a probabilidade de ocorrência de um determinado número de eventos em um determinado (fixo) período de tempo, se os eventos ocorrem a uma taxa constante (conhecida) e são independentes da ocorrência do evento anterior. É baseado em uma distribuição discreta de probabilidade, onde o conjunto de resultados são discretos ou finitos, como o lançamento de uma moeda ou lançamento de dados.
In the context of a digital PCR experiment, the discrete outcomes are the presence or the absence of the target gene. Espera-se que os milhares de partições individuais produzidas para uma reacção PCR digital sigam uma distribuição de Poisson, considerando que as partições são monodisterizadas e contêm o volume equivalente da mistura de amostras.
se estes parâmetros não forem atingidos e as divisórias apresentarem polidispersibilidade, o volume de mistura de amostras nas divisórias variará em grande medida e as divisórias maiores poderão conter mais alvos do que as menores, reduzindo a precisão da reacção PCR digital.
neste item, nós o guiamos através da Computação Matemática da Lei Poisson para um experimento de PCR digital.
para um experimento de PCR digital, um poço contendo a amostra particionada de interesse, e um gene alvo para quantificar, primeiro precisamos definir as seguintes variáveis:
- \(N\): número total de analisável partições no bem
- \(p\): número de partições para o gene alvo
- \(v\): volume da partição (em µL), considerado constante
- \(d\): fator de diluição usado para diluir a amostra de ações para o bem
(e.g. \(d=10\) significa que a amostra foi diluída 10 vezes)
e, em seguida, estes adicionais:
-
\(V = N \ v\) : total da partição do volume injetado no poço
-
\(C_{0}\) : a concentração de genes alvo para o bem (em cópias/µL)
-
\(C = d \ C_{0}\) : concentração de genes alvo em estoque (em cópias/µL)
-
\(\lambda = C_{0} \ v\) : média do número de genes alvo por partição em que o bem
A distribuição dos genes alvo encapsulado em partições do bem segue uma distribuição de Poisson de parâmetro \(\lambda\) :
Proba ( partição encapsula \(\text{$k$}\) os genes alvo ) \(= \dfrac{\lambda^} {k! uma partição é dita:
-
“Positivo a partição” se ele tem encapsulado pelo menos 1 gene alvo (no caso, vamos observar uma fluorescente de partição em que o ponto final do processo de amplificação, assim que a maioria da incerteza encontra-se neste “pelo menos um” condição)
-
“Negativa de partição” se tem encapsulado 0 gene alvo (no caso, vamos observar um não-fluorescente partição em que o ponto final do processo de amplificação)
A distribuição de positivo partições no bem segue uma distribuição binomial de probabilidade \(1 – e^{-\lambda}\):
- Probabilidade (também contém \(\text{$p$}\) positivo partições \(= {\rm C}_{N}^{p} (1 – e^{-\lambda})^p e^{-\lambda} )^{N-p} \)
- Probabilidade (partição é negativo) \( = e^{-\lambda} \)
- Probabilidade (partição é positivo) \( = 1 – e^{-\lambda} \)
Se \(N\) é grande o suficiente:
- Proba (partição é positivo) \(= \dfrac{p}{N} \)
Assim, a fórmula para a estimativa de estoque de concentração é:
\ C = – \dfrac{d}{v} \ ln{\left(1 – \dfrac{p}{N} \right)} \)
Se você precisa calcular automaticamente estimado concentrações de genes alvo, juntamente com seu intervalo de confiança e incerteza relativa, uma ferramenta on-line está disponível: Poisson Lei: Ir Mais longe. Experimenta!
para mais informações sobre as curvas de incerteza, bem como os limites de detecção e quantificação, ver o item: gamas dinâmicas de detecção & quantificação.